百里醌對大鼠腸缺血再灌注損傷的保護作用

吉祖進 張志云 雷新益 楊勇 蔣學軍 庹磊

(國藥東風總醫院，湖北 十堰 442008)

腸缺血再灌注損傷(intestinal ischemia reperfusion，IIRI)是臨床上比較常見的病理生理過程，可由急性腸系膜缺血、嚴重感染、創傷性休克和外科手術引起，它進一步導致全身炎癥反應綜合征( systemic inflammatory response syndrome，SIRS)和多器官功能障礙(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)的發生[1-2]。腸缺血后，雖然恢復血流灌注和復氧過程至關重要，矛盾的是，再灌注過程同時也會造成額外的細胞損傷，其病理機制可能與氧化應激、炎癥因子釋放和細胞凋亡等多種因素相關[3-4]。黑種夏草是原產于地中海和中東地區常用的生物藥材，一直被廣泛用于支氣管哮喘、糖尿病、高血壓等疾病的治療[5]。百里醌( thymoquinone)是黑種夏草種子提取物中的主要活性成分。研究顯示，在多種器官的IIRI過程中, 百里醌發揮了抗氧化、抗凋亡及抗炎等作用[6-7]。本研究通過建立大鼠腸IIRI模型，觀察百里醌在大鼠腸IIRI過程中的保護作用，為腸IIRI的防治提供新的手段。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑及器材 百里醌，上海哈森公司產品；無水乙醇，美國 Sigma 公司；丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶(SOD)檢測試劑盒,南京建成生物工程研究所；原位細胞凋亡檢測試劑盒，德國羅氏生物技術公司； RNA 提取試劑盒及逆轉錄試劑盒,美國GeneCopoeia 公司；ECL試劑盒：皮爾斯生物科技公司；Bax、Bcl-2及Caspase-3抗體購自圣克魯斯生物技術公司。百里醌用無水乙醇溶劑并配制成1 mol /L 的貯存液，-20 ℃冰箱保存。

1.2 實驗動物和分組 45只健康雄性Wistar大鼠, 體重250～300g，隨機分為3組，每組15只。實驗前，所有大鼠飼養在恒溫房間，自由進食和水。所有大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(50mg/kg)進行麻醉，取腹正中切口，分離并暴露腸系膜上動脈(superior mesenteric artery，SMA)。假手術對照組(A組)僅游離SMA，不給予任何干預措施，觀察3 h。 缺血再灌注組(B組)使用無損傷動脈夾夾閉SMA 1 h后，取下動脈夾再灌注2h。缺血再灌注+百里醌組(C組):在B組基礎上，再灌注同時腹腔注射百里醌(50 mg /kg )。術畢，快速脫頸椎法處死所有大鼠，采集距大鼠小腸回盲部10 cm以上的腸組織作為標本。

1.3 HE 染色 小腸組織沖洗干凈后置于4%的甲醛溶液中固定，常規石蠟包埋，4μm厚切片、脫蠟和水化，觀察小腸組織的形態學改變。

1.4 MDA和SOD測定 冷凍的小腸組織勻漿、離心，然后收集上清液。MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定，SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法，按照說明書指示進行操作。

1.5 細胞凋亡檢測 利用末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記(TUNEL)法檢測細胞凋亡，細胞核染成棕黃色者為陽性細胞，計算細胞總數和陽性細胞數。凋亡指數(AI)= 陽性細胞數/細胞總數×100%。

1.6 逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR) 凍存的小腸組織樣本，加入Trizol試劑提取總RNA。取1μg 總RNA逆轉錄成cDNA，采用PCR基因擴增儀進行擴增。反應方案依據試劑盒說明書操作步驟，條件為: 逆轉錄52℃ 15min，92℃ 40s；循環條件為: 90℃ 30s、54℃ 10s、72℃ 40s，40個循環。引物序列：caspase-3正義鏈5'-TGGACTGCGGTATTGAGACA-3'；反義鏈5'-GCGCAAAGTGACTGGATGAA-3'；Bax正義鏈5'TGAACTGGACAACAACATGGAG3'；反義鏈5'AGCAAAGTAGAAAAGGGCAACC3'；Bcl-2正義鏈5'-ATGCTTCAGACCTCCCTT-3'；反義鏈 5'-CTCCACCAACTATCTCCACT-3'；GAPDH正義鏈5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3'；反義鏈5'-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'。軟件分析各組的循環閾值(Ct)，最終數據以2-△△Ct進行分析，得出各組基因的表達量。

1.7 Western blot法檢測各組小腸組織中caspase-3、Bax和Bcl-2 蛋白表達水平 取凍存小腸組織約100mg，放入預冷的1000μl細胞裂解液中勻漿，離心并吸取上清液。取等量勻漿蛋白，經10%的SDS-PAGE進行凝膠電泳，將其轉移到硝酸纖維素膜上，5% 脫脂奶粉封閉。1∶500稀釋抗Bax抗體,1：1000稀釋抗Bcl-2和caspase-3抗體，與硝酸纖維素膜4℃孵育過夜。漂洗兩次, TBST緩沖后，1∶ 500 HRP 標記的山羊抗小鼠IgG 后，采用增強化學發光法(ECL) 測定光密度值。

2 結果

2.1 腸缺血再灌注模型的建立 使用無損傷動脈夾夾閉腸系膜上動脈。模型制備成功的標準：腸系膜上動脈遠端動脈搏動消失，漸變蒼白，恢復灌注前小腸段發黑，水腫明顯,見圖1。

圖 1 動脈夾夾閉腸系膜上動脈Figure 1 Artery clamps occluded the superior mesenteric artery

2.2 各組大鼠小腸組織的病理學改變 A組未見明顯的組織病理學改變，黏膜上皮排列整齊，形態結構完整，腸黏膜無充血，無水腫；B組可見腸絨毛排列紊亂，明顯腫脹、變粗，腸黏膜壞死；C組可見形態結構的破壞損傷較B組減輕，腸黏膜部分壞死，腸絨毛未見明顯水腫，見圖2。

圖2 小腸組織病理學改變 (HE×100)Figure 2 Histopathological changes of small intestine (HE×100)注：A.假手術對照組，B.缺血再灌注組，C.缺血再灌注+百里醌組

2.3 各組小腸組織中MDA、SOD含量的變化 B組中MDA含量較A組明顯增加，百里醌治療后MDA含量顯著降低，組間比較,差異均有統計學意義(P<0.05)；與A組相比，B組SOD活性明顯降低，百里醌治療后增加了小腸組織中SOD的活性，組間差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

Table1ChangesofthecontentsofMDAandSODinthesmallintestine

組別nMDA(nmol/mg)SOD(U/mg)A組152.83±0.36135.37±3.34B組159.23±0.78 ①76.45±1.39 ①C組154.97±0.45 ①②95.13±1.64 ①②

注：與A組比較，①P<0.05；與B組比較，②P<0.05

2.4 各組腸黏膜上皮細胞凋亡情況 A組可見散在較少的腸黏膜上皮細胞凋亡；B組中凋亡細胞明顯增加,與A組相比，差異有統計學意義(P<0．05)；C組細胞凋亡較B組明顯減少，差異有統計學意義(P<0．05)，見表2。

表2 腸黏膜上皮細胞凋亡指數Table 2 Apoptosis index of intestinal mucosal epithelial

注：與A組比較，①P<0.05；與B組比較，②P<0.05

2.5 各組小腸組織中caspase-3、Bax和Bcl-2 mRNA的表達水平 Bax、caspase-3在B組中的mRNA表達水平，與A組比較顯著增加；與B組比較,百里醌治療(C組)后其mRNA表達水平降低,組間差異有統計學意義(P<0．05)。與A組比較，B組中Bcl-2在mRNA表達水平明顯減低；C組中mRNA表達水平較B組明顯增加，組間差異均有統計學意義(P<0．05)，見圖3。

圖3 小腸組織中caspase-3、Bax和Bcl-2 mRNA的表達水平Figure 3 The mRNA expression levels of caspase-3, Bax and Bcl-2 in the small intestine tissues注：A.假手術對照組，B.缺血再灌注組，C.缺血再灌注+百里醌組；與A組比較，①P<0.05；與B組比較，②P<0.05

2.6 各組小腸組織中caspase-3、Bax和Bcl-2 蛋白表達水平 與A組比較，Bax、caspase-3在B組中的表達水平增加；百里醌治療(C組)后其表達水平降低,組間差異均有統計學意義(P<0．05)。Bcl-2在B組中的表達水平，與A組比較顯著降低；與B組比較,百里醌治療(C組)后其表達水平增加, 組間差異均有統計學意義(P<0．05)，見圖4。

圖4 小腸組織中caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達水平Figure 4 The protein expression levels of caspase-3, Bax and Bcl-2 in the small intestine tissues注：A.假手術對照組，B.缺血再灌注組，C.缺血再灌住+百里醌組，與A組比較，①P<0.05；與B組比較，②P<0.05

3 討論

百里醌是從黑種夏草種子中提取的具有生物活性成分單體，具有廣泛的藥理作用，研究發現百里醌具有多種生物學作用。Galaly等[8]報道，百里醌激活內皮細胞分泌生長因子，促使平滑肌細胞大量增殖，從而在肝細胞的損傷中發揮抗凋亡及抗炎作用。Shao等[9]研究發現，百里醌可通過降低氧化應激水平，對大鼠腦細胞損傷的功能產生保護作用。本實驗采用HE染色觀察百里醌對IIRI大鼠小腸組織學變化的影響。結果顯示，IIRI組出現明顯的病理學變化，比如腸絨毛排列紊亂、腸黏膜壞死等表現；經百里醌治療后，小腸IIRI引起的組織學損傷得到明顯好轉及改善。

氧化應激是機體內活性氧自由基(ROS)大量積累的結果，ROS也是器官IIRI發展的重要因素, 大量ROS的產生可打破氧化和抗氧化之間的平衡，引起組織損傷[10]。當小腸血供中斷引起缺血時，機體內ROS清除能力明顯降低，再灌注損傷時則進一步誘發產生大量ROS, 過量的ROS可以氧化細胞膜蛋白、脂質和DNA，導致一系列細胞功能障礙或死亡[11-12]。正常情況下，MDA是脂質過氧化分解產生的最終產物,通常用于評估氧化應激下細胞損傷的程度。SOD水平是細胞生長、分化過程中的重要組成部分, 其抗氧化能力可改善IIRI的損傷[13]。Cobourne-Duval 等[14]發現，百里醌可明顯減少ROS的生成，從而抑制大鼠中樞神經系統中的氧化應激水平，在減慢或防止小膠質細胞源性神經退行性疾病發生發展中，可作為一種有效的治療劑。Al-Majed等[15]通過百里醌腹腔注射的方法，發現其可有效地減少急性腹主動脈缺血再灌注大鼠模型中氧化應激的病理損傷。本實驗研究表明，經百里醌治療后，可使IIRI小腸組織中的MDA含量降低，SOD活性升高，從而減輕了腸IIRI過程中氧化應激造成的損傷。

細胞凋亡是一種基于遺傳學機制的細胞死亡模式，通過誘導一系列形態和生化的改變導致細胞死亡的過程，在維持機體的動態平衡中發揮重要的作用[16]。IIRI時，由于能量的消耗，活性代謝產物的大量生成，激活線粒體信號轉導通路，引起大量細胞凋亡,使機體發生損傷[17]。Kojima等[18]認為在腸IIRI過程中，氧化應激水平的升高可進一步誘導黏膜上皮細胞發生異常凋亡。 Caspase-3是細胞凋亡過程中的關鍵效應酶，也是多種凋亡刺激信號最終的匯聚點[19]。Bcl-2是一組家族蛋白，其中包含促凋亡因子(如Bax)和抗凋亡因子(如Bcl-2)，它們是近年來發現的一對關系密切的凋亡基因，其變化是細胞凋亡損傷中另一個重要的因素[20]。本實驗IIRI組中, Bax、caspase-3表達明顯高于對照假手術組，Bcl-2表達低于對照假手術組, 其凋亡指數(AI)顯著升高；百里醌治療后，Bax，caspase-3的表達明顯降低，Bcl-2表達明顯增多，提示百里醌在小腸IIRI過程中具有抑制凋亡的作用。

4 結論

本實驗結果顯示，百里醌可減輕實驗大鼠的氧化應激水平，發揮抗凋亡作用, 從而在腸IIRI過程中發揮保護作用。這些發現為我們更好地理解百里醌在臨床治療中的作用提供了依據,無疑將為未來IIRI治療提供新的思路。