長鏈非編碼RNA DRAIC調控miR-223對胃癌細胞遷移和侵襲的影響

鄧清 張鐵泉 樂問津 黃強 李宓

(荊州市第一人民醫院肝膽外科，湖北 荊州 434000)

胃癌是全世界范圍內消化系統最常見的惡性腫瘤之一，其腫瘤類型主要為腺癌[1]。據世界衛生組織統計，中國男性胃癌發病率占所有惡性腫瘤的第七位，死亡率約占所有惡性腫瘤的10%[2-3]。隨著臨床研究不斷進展，胃癌的臨床診斷率不斷提升，但是關于晚期胃癌的治療和預后檢測仍進展不大。因此，探討胃癌發病進展的準確分子機制是目前研究的熱點。

長鏈非編碼RNA(LncRNA)是一類具有超過200個核苷酸序列的非編碼RNA，參與不同種類惡性腫瘤的進展過程[4]。對于胃癌，LncRNAH19及lncRNAMEG3已被明確為胃癌的活性致癌基因，對胃癌細胞的生物學行為有直接的影響[5]。 據報道，目前已有多種LncRNA與腫瘤進展途徑相關，包括PCGEM1[6]、SOCS2-AS1[7]、PlncRNA-1[8]和DRAIC[9]，都有可能成為有效的腫瘤標志物。有學者證明lncRNA H19通過阻斷AR和E3泛素連接酶MDM2之間的相互作用來阻止AR泛素化和降解，達到抑制胃癌細胞的生長[10]。

最近的研究表明，miR-223可能在各種惡性腫瘤中起關鍵調控作用。據以前的研究，在前列腺癌中miR-223下游的兩個轉錄物可以直接促進前列腺癌細胞凋亡[11]。在最新的研究中指出，miR-223可以通過靶向AKT/mTOR信號通路來阻礙肝細胞癌的發展[12]。然而目前仍然缺乏關于miR-223功能的確切機制。為了探索長鏈非編碼DRAIC和miR-223在胃癌中的功能及其相關影響，本文分析兩者在胃癌中的表達情況及生物學行為的檢測(包括細胞遷移和侵襲實驗)，旨在為胃癌患者提供一個潛在的新的治療和預后靶標。

1 材料與方法

1.1 細胞株及實驗材料 人胃癌細胞株BGC-823、AGS、HCG-27及SGC-7901細胞購買于復旦大學細胞所，在含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養基中培養。DRAIC-siRNA和陰性對照(NC)購自中國上海GenePharma生物有限公司；脂質體Lipofectamine 2000模擬物購自上海吉凱基因公司；TRIrizol購自美國Ambion公司；逆反轉錄試劑盒(FSQ-101)購自日本TOYOBO公司；PCR試劑盒購自美國Kapa公司。選擇2016年1月～2016年12月 在本院接受胃癌切除術的患者得到新鮮的胃癌和相鄰正常組織，手術切除后立即將組織放置液氮冷凍，儲存于-80℃冰箱保存備用。來自病理科的胃癌組織均獲得了醫院保護人類受試者委員會的批準，并獲得了所有患者的知情同意書。

1.2 定量實時PCR(qPCR)分析 將SGC-7901細胞接種在12孔板中，生長至50%融合以進行siRNA轉染，90%用于質粒轉染。根據制造商的方案，使用Lipofectamine 2000轉染質粒和siRNA。在轉染后第3d，收獲細胞，并使用TRIZOL試劑提取總RNA。使用ImProm-II TM逆轉錄系統對總RNA水平進行qPCR分析。所有反應用Step-One Plus實時PCR系統進行，使用2-△△Ct計算法分析qPCR的實驗數據。實驗重復3次。DRAIC-siRNA的siRNA序列：F：(正向)5’-AATGAGGCGAGGGCTGGGGAACCTA-3’，R：和(反向)5’-TTGAGGGCGGAGGGTCGGAaatGGC-3’。miR-204，F：的前引物(正向)5’-AATGAGGGTGGGGGCGAGCGAAGGT-3’，R：和(反向)5’-AATGCGGATGCGGGAGGGGCGGGAGC-3’。

1.3 熒光素酶報告基因測定 驗證DRAIC和miR-223的相關關系使用雙熒光素酶測定，將24孔板中的DRAIC和NC細胞與0.4mg螢火蟲熒光素酶報告載體和0.08mg含有海腎螢光素酶(Promega)的pRL-TK對照載體共轉染，使用 siPORTneoFX(Ambion，Austin，TX)，根據使用方法操作，在轉染后48h制備裂解物。 使用雙光發光報告基因測定(Applied Biosystems)測量熒光素酶活性。將螢火蟲熒光素酶活性標準化后測定海腎螢光素酶活性。實驗重復3次。

1.4 蛋白質印跡測定 使用RIPA緩沖液提取總細胞裂解物，通過配置12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，并轉移到PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉，并在4℃下與一抗(濃度1:1000)一起孵育過夜。 隨后將膜與二抗孵育，最后用ECL底物試劑盒檢測，實驗重復3次。

1.5 劃痕愈合實驗 將胃癌細胞接種于6孔板，待細胞融合度生長在90%時，用200μl消毒槍頭垂直劃線，并在顯微鏡下測量劃痕的初始距離(0 h)，在恒溫孵箱中孵育72h后，測量劃痕的距離，并計算細胞的遷移率。細胞遷移率的計算公式=[遷移距離D(0h)-遷移距離D(72h)]/ 遷移距離D(0h)。實驗重復3次。

1.6 Transwell侵襲實驗 將Transwell小室置于24孔板內，將Transwell小室內膜均勻涂抹Matrigel膠100μl，37℃孵育20min，逐步消化、離心、計數細胞后，按照2.5×104/ ml用無血清培養基將胃癌細胞稀釋，制成細胞懸液；按照每孔200μl的細胞懸液加入Transwell上室；孵育24h后使用甲醛固定細胞，結晶紫染色15min，使用棉簽去除小室內膜上的細胞，然后于顯微鏡下計數，觀察4個高倍視野(×40)下穿過濾膜的細胞數。實驗重復3次。

1.7 流式細胞儀分析 流式細胞術檢測SGC-7901胃癌細胞凋亡情況。將SGC-7901細胞以2×105/孔的濃度接種在6孔板中，分別用NC和DRAIC-siRNA轉染，轉染72h后，通過FITC標記的AnnexinV/碘化丙啶細胞凋亡檢測試劑盒檢測凋亡細胞情況。實驗重復3次。

2 結果

2.1 DRAIC在胃癌組織、癌旁正常組織和胃癌細胞株中的表達情況 qPCR檢測結果表明，與癌旁正常組織相比，胃癌組織中DRAIC表達水平明顯較高[(2.12±0.28) vs (0.59±0.15)]，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖1A；DRAIC在SGC-7901細胞株中表達水平比其他細胞株明顯增高[(1.91±0.17) vs (1.21±0.15)vs(0.77±0.13) vs (0.82±0.18)],差異均有統計學意義 (P<0.05)，見圖1B。綜合上述試驗結果，我們推測DRAIC在胃癌中可能扮演一定的促癌作用，并挑選SGC-7901為進一步生物學功能實驗的細胞株。

圖1 DRAIC在胃癌組織和細胞株中的表達情況Figure 1 DRAIC expression in gastric cancer tissues and cell lines注：A. DRAIC在胃癌組織和正常組織中的表達情況；B. DRAIC在不同胃癌細胞株中的表達情況，①P<0.05

2.2 DRAIC和miR-223之間的調控關系 通過生物信息學預測網站篩選與DRAIC有直接作用的miRNA分子，miR-223的3’UTR與DRAIC具有相似的結合位點。進一步通過雙熒光素酶驗證DRAIC與miR-223的 3’UTR結合調控情況，將DRAIC與miR-223共轉染到293T細胞中，雙熒光素酶報告基因結果顯示,DRAIC可以明顯抑制野生型miR-223-3’UTR的熒光素酶活性，但不能調控突變型miR-223-3’UTR的活性,見圖2，表明DRAIC能與miR-223的3’UTR特異性結合，且可調控miR-223的表達活性。

2.3 DRAIC調控胃癌細胞細胞周期和凋亡行為 細胞凋亡實驗顯示，DRAIC-siRNA實驗組的細胞凋亡速率明顯高于NC對照組的細胞凋亡比率[(16.33±2.16)% vs(10.05±1.98)%]，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3A；抑制DRAIC的表達后阻滯于G1期細胞增多[(71.14±8.36)% vs(66.77±6.57)%]，S分裂期細胞減少[(19.92±3.15)% vs(21.94±4.21)%]，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖3B,表明抑制DRAIC的表達后，胃癌細胞的凋亡行為得到一定程度的促進。

圖2雙熒光素酶實驗檢測DRAIC和miR-223之間的相互關系

Figure2LuciferaseassaytodeterminethecorrelationbetweenDRAICandmiR-223

注：與突變型比較，①P<0.05

2.4 DRAIC調控胃癌細胞的遷移和侵襲行為 Transwell侵襲實驗結果顯示, 抑制DRAIC的表達后，DRAIC-siRNA組細胞的侵襲數目明顯少于NC組[(128.6±18.2)vs(31.5±7.6)]，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4A, 表明抑制DRAIC的表達在一定程度上可以抑制胃癌細胞的侵襲能力。劃痕愈合實驗結果顯示, 抑制DRAIC的表達后，胃癌細胞的遷移能力受到一定的抑制；72h后，DRAIC組細胞的遷移比率明顯低于NC組[(82.45±7.62)% vs(22.31±4.42)%]，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4B，表明抑制DRAIC的表達在一定程度上可以抑制胃癌細胞的遷移能力。

圖3 DRAIC和miR-223之間的調控關系Figure 3 The regulatory relationship between DRAIC and miR-223注：A.流式細胞術檢測DRAIC對胃癌細胞凋亡行為的影響;B.流式細胞術檢測DRAIC對胃癌細胞細胞周期進程的影響

3 討論

胃癌是全球消化系統死亡率第二高的惡性腫瘤，在亞洲每年大約有60%的患者被診斷為胃癌，其中中國的發病率約占全球胃癌患者總數的42%[14]。盡管目前胃癌的手術技術有所改善，且輔助治療方式不斷進步，但是胃癌的死亡率仍居高不下，這主要是因為早期胃癌診斷困難和晚期胃癌發生遠處轉移[15-16]。因此，需要提高對胃癌機制的認識和特異性生物分子標志物的識別，有助于胃癌的早期預測和臨床療效的改善。

據報道，LncRNA參與不同種類的惡性腫瘤的進展過程[17]。在胃癌中，眾多的LncRNA與腫瘤轉移信號通路途徑相關，從而可以作為胃癌發生發展的檢測因子。有學者發現，LncRNA中的LINC01138和SUZ12P1可以在一定程度上促進前列腺癌的增殖[18]。同時有研究指出，GAS5可以通過調節CCL1的表達參與膀胱移行細胞癌的侵襲行為[19]。Hotair通過結合YBX1負調節人神經膠質瘤細胞的存活和增殖能力[20]。在胃癌中關于腫瘤調控因子有眾多的組織類型差異，通過使用公共數據庫發現，胃癌組織樣品中DRAIC的表達顯著上調。

為了深入了解DRAIC在胃癌細胞中的更多潛在作用，本實驗首先檢測了DRAIC在胃癌組織和細胞株中的表達情況，然后檢測DRAIC對胃癌細胞株遷移和侵襲行為的具體影響。之前相關研究指出，DRAIC相關基因與翻譯延伸、蛋白質生物合成、RNA剪接、蛋白質結合與核糖體的結構成分相關，主要參與調節轉錄、信號轉導、修飾依賴性蛋白質分解代謝、蛋白結合和鋅離子結合等細胞因子行為，表明DRAIC在胃癌的發展過程中扮演核心的調控作用。

圖4DRAIC調控胃癌細胞的遷移和侵襲行為
Figure4DRAICregulatesthemigrationandinvasionofgastriccancercells

注：A.Transwell侵襲實驗檢測DRAIC對胃癌細胞侵襲能力的影響; B.劃痕愈合實驗檢測DRAIC對胃癌細胞遷移能力的影響

本實驗證實了SGC-7901胃癌細胞的遷移和侵襲能力被DRAIC因子所調控，且和miR-223分子的表達相關。值得注意的是，miR-223已被報道是前列腺癌中的腫瘤調控因子，發揮一定的抑癌作用[21]。本研究中miR-223在胃癌中扮演的作用與之前前列腺癌中的報道不一致，推測可能miR-223具有一定的組織特異性，在不同類型的腫瘤組織中表達存在差異。

4 結論

本研究結果顯示，DRAIC在胃癌中的高表達和miR-223共同調控胃癌的發生發展及遷移轉移行為，這有可能成為預測胃癌進展、預后和監測治療效果的分子標志物。