熱休克蛋白Gp96在肝癌、肝纖維化、乙型肝炎中作用的研究進展

高 熙，李三強

(河南科技大學醫學院肝臟損傷與修復分子醫學重點實驗室，河南 洛陽 471003)

熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)Gp96是HSP90家族的重要一員，廣泛存在于真核細胞內質網中，在機體應激情況下,發生過表達,并作為分子伴侶調節蛋白質的折疊、轉運、分泌和降解，參與多種肝臟疾病的發生、發展過程[1-2]。Gp96在不同肝臟疾病中存在著不同的作用機制。本文就Gp96在肝癌、肝纖維化、乙型肝炎等肝臟疾病中作用的國內外相關研究綜述如下。

1 Gp96在肝癌中的作用

肝癌是發病率居我國第4位的惡性腫瘤，居腫瘤致死病因的第3位，嚴重威脅著人們的健康[3-4]。Gp96高表達于不同惡性腫瘤中，說明Gp96的表達與腫瘤進展之間存在聯系[5-7]。多項研究[8-9]表明，Gp96可能在肝癌的發生、發展中起作用。

1.1 Gp96在肝癌發生中的作用Rachidi等[8]采用白蛋白-環化重組酶小鼠與Gp96浮動小鼠雜交來系統研究Gp96在肝癌中的作用。結果表明，Gp96在機體內有著維持肝臟穩態的作用，在人肝癌中的遺傳和藥理抑制作用干擾了多種生長信號，并抑制了肝癌細胞的增殖。Gp96的失活會促進長鏈神經酰胺的適應性積累，并伴隨著殘余Gp96肝細胞的脂肪再生。Gp96背景中的Gp96陽性細胞需要代償性擴增，使小鼠在Gp96陽性肝細胞中產生致癌物所致的肝細胞增生和腫瘤。Huang等[9]發現高表達Gp96反映了低應答和低存活率。Gp96在肝癌細胞株中的表達高于正常肝細胞系。此外，Gp96的缺失對某些腫瘤細胞的增殖有明顯的抑制作用。在小鼠異種移植模型中，當Gp96沉默時可能通過抑制蛋白激酶B(AKT)/內皮細胞一氧化氮合酶通路來顯著抑制肝癌細胞的增殖，這提示了Gp96/AKT信號可能是腫瘤治療的潛在靶點。盛春海等[10]在人肝癌Huh7細胞系中轉染了野生型和miR-642a結合位點突變的Gp96 3’UTR的螢光素酶報告基因質粒，并通過PCR和Western-blot等方法檢測miR-642a和DOHH的mRNA及其蛋白水平。實驗結果發現Gp96 mRNA的3’UTR作為內源競爭RNA可上調腫瘤基因DOHH的表達，促進了肝癌的發生、發展。Chen等[11]采用白蛋白-環化重組酶系統建立了肝特異性Gp96基因敲除小鼠模型，發現Gp96缺乏可導致肝祖細胞過度增殖并伴輕度肝損傷，其與細胞黏附受損有關。肝臟中Gp96的缺失可選擇性激活細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)，促進肝癌的發展。Wang等[12]用戊二醛交聯法構建了含有分子伴侶Gp96和甲胎蛋白(alpha-fetoprotoine,AFP)的蛋白疫苗來研究Gp96是否能提高AFP的免疫原性以及Gp96能否協同增強AFP治療效果。結果表明，AFP和Gp96協同作用能夠顯著增強AFP特異性CD8細胞反應，對AFP表達的腫瘤有顯著抗腫瘤作用。吳信華等[13]在探討抑制Gp96對HepG2細胞中人端粒酶逆轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)表達及細胞增殖的影響中發現，HepG2細胞中Gp96及hTERT的表達較正常均升高，而加入HSP90抑制劑戈爾德霉素可使兩者表達顯著減少，同時HepG2細胞增殖也明顯受到抑制，因此可以說明Gp96在肝癌細胞中通過影響hTERT的活性，從而影響肝癌細胞端粒酶復制和細胞增殖，最終達到影響肝癌的發生、發展的目的。Zhang等[14]發現從H22肝癌細胞中提純Gp96-肽復合物在體外對小鼠腹腔巨噬細胞(peritoneal exudative macrophage, PEMφ)的免疫功能具有直接激活作用：Gp96不僅可以增加PEMφ殺瘤效應分子一氧化氮和活性氧的產生，增強非特異性抗腫瘤作用，還可以激活PEMφ，上調抗原遞呈分子的表達，增強抗原呈遞的能力，說明Gp96可以通過影響巨噬細胞的功能來對抗肝癌。Wang等[15]采用人肝癌細胞株SMMC-7721中的Gp96沖擊樹突狀細胞，激活自體T細胞，發現Gp96沖擊的樹突狀細胞具有刺激自體T細胞增殖和誘導SMMC-7721特異性細胞毒性T淋巴細胞的功能，即針對腫瘤特異性抗原，表現出主要組織相容性復合體Ⅰ類限制性細胞毒性；其還可以通過增強人類白細胞抗原Ⅱ類、CD80、CD86、CD83和CD40的表達而誘導樹突狀細胞的成熟。結果表明，Gp96可以誘導多種抗腫瘤免疫反應，而不需要預先識別腫瘤相關抗原。

1.2 Gp96在肝癌轉移中的作用Wei等[16]用一種特異的短發夾RNA下調了Gp96基因在肝癌細胞中的表達，通過傷口愈合遷移、跨孔遷移和侵襲性測定，確定了肝癌細胞的遷移和侵襲性，證實沉默Gp96可抑制肝癌細胞的愈合、遷移和侵襲，并提示Gp96基因敲除可能通過抑制c-Jun信號來抑制肝癌細胞的轉移。Wu等[17]研究發現Gp96能夠誘導肝癌細胞周期阻滯，并顯著減少細胞凋亡。通過分析凋亡相關蛋白來鑒定p53為Gp96客戶端蛋白，并推測Gp96作為支架蛋白增強MDM2 E3連接酶活性，從而增加P53的泛素化和降解。P53是一種抑癌基因，其突變體能夠使細胞持續增殖、減少凋亡，從而促進腫瘤細胞轉移。此外，Gp96基因敲除對體內肝癌細胞生長有明顯的抑制作用，促進了細胞凋亡。Hou等[18]發現血漿膜Gp96可以通過調節uPAR增強肝臟的侵襲和轉移潛能。他們對88例原發性肝癌患者的漿膜Gp96水平進行了分析，結果表明，漿膜Gp96高表達時，肝臟腫瘤中尿激酶型纖溶酶原激活劑受體(urokinase-type plasminogen activator receptor,uPAR)的表達水平也相應增加。用siRNA靶向漿膜Gp96或阻斷漿膜Gp96-uPAR相互作用的特異性單克隆抗體在體外會抑制細胞的生長、存活和侵襲，并抑制肝癌的體內生長和轉移。漿膜Gp96通過增加uPAR的蛋白穩定性和信號轉導促進肝癌的進展，可能是抑制uPAR介導的肝癌生長和轉移的新靶點。

2 Gp96在肝纖維化中的作用

趙彩霞等[19]用四氯化碳促進大鼠發生肝纖維化，觀察大鼠肝臟組織的病理學變化及肝纖維化進展的程度，并同時測定Gp96的表達量。結果發現肝纖維化的嚴重程度與Gp96的表達水平呈正相關，說明Gp96可以促進肝纖維化的發生、發展。

3 Gp96在乙型肝炎中的作用

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是世界性的重大公共衛生問題。有3.5億多人長期慢性感染，慢性乙型肝炎患者有高度的危險性發展為肝硬化、肝功能衰竭和肝細胞癌[20]。Gp96可能在抗HBV中起著一定的作用。Wang等[21]研究了Gp96介導的細胞免疫和體液免疫在HBV轉基因小鼠抗病毒作用中的價值。他們通過乙肝表面抗原(HBsAg)和核心抗原(HBcAg)聯合免疫聯合Gp96誘導抗病毒T細胞和抗HBsAg、HBcAg抗體免疫。通過與未免疫對照組相比，他們發現Gp96處理組細胞對HBcAg的反應明顯增強，CD8陽性T細胞浸潤明顯增加,并且Gp96可使調節性T細胞(T regulatory cells,Tregs )降低30%～40%。實驗結果說明, Gp96可能通過增強Balb/c和轉基因小鼠的體液和T細胞應答，降低Tregs頻率，增強抗HBV的活性。Li等[22]采用從正常小鼠肝臟中分離到的Gp96及其在大腸桿菌中表達的N端片段用于Balb/c小鼠的免疫接種。通過給8組小鼠皮下分別注射磷酸鹽緩沖液、Gp96、N端片段、單純HBsAg、HBsAg Gp96、HBsAg N端片段、HBsAg不完全佐劑、HBsAg N端片段(95 ℃加熱30 min)的磷酸鹽緩沖液，用酶聯免疫吸附試驗檢測血清抗HBsAg抗體水平后發現，HBsAg與Gp96或其N端片段免疫小鼠血清抗HBsAg抗體的平均滴度明顯高于ELISA檢測的HBsAg。他們認為Gp96或其N端片段可顯著改善HBsAg誘導的體液免疫應答，但不能增強細胞毒性T淋巴細胞反應，提示Gp96或其N端片段可增強HBV感染體液免疫應答。Lin等[23]通過體外共培養實驗得出，Gp96刺激可增強Tregs增殖和抑制作用，而Gp96誘導的叉頭樣轉錄因子p3、白介素-10和轉化生長因子-β1的上調依賴于Toll樣受體2和Toll樣受體4介導的核因子κB的激活。通過高劑量Gp96免疫激活Tregs，可防止刀豆蛋白A和抗CD137誘導的T細胞肝臟炎癥，并可對抗導致肝臟破壞的免疫亢進。

4 結語

Gp96在人體內廣泛表達，與肝癌、肝纖維化、乙型肝炎等肝臟疾病的發生、發展密切相關，在肝臟疾病的發生、發展和轉移中存在著不同的作用機制，從不同的方面影響著肝臟疾病的進展。因此，對于Gp96的深入研究可以更有助于肝臟疾病的臨床診斷，并可以作為肝臟疾病預防和治療的新靶點。然而由于實驗的局限性，對Gp96在肝臟多種疾病中的作用機制、作用特點還有待進一步更加深入的研究。