組織與細胞培養在植物育種中的研究進展及其應用

龔建軍，鐔美霞

（武威職業學院現代農業技術系，甘肅 武威 733000）

植物組織與細胞培養體系在育種研究和商業應用中具有巨大的潛能，在商業應用和細胞生物學、遺傳學、生物化學等基本研究中發揮著越來越大的作用。自德國植物學家G.Haberlandt發表關于植物葉肉細胞培養的研究開始，植物組織與細胞培養技術已經過110多年的發展，現在已成為科學研究的工具和加快生產進程的途徑。隨著植物組織與細胞培養技術的逐漸完善，其在植物遺傳育種等領域的應用越來越廣，為植物新類型的創造和培育優良作物品種以及生產次生代謝物質（如醫藥、香料等植物化學成分）等領域開辟了新的途徑；隨后，在生產中涌現出許多應用成功的案例，發展速度比預期要迅速，但也面臨很多困難和障礙。目前，植物組織與細胞培養在植物育種方面取得了以下幾個方面的較大進展。

1 種質資源保護

種質資源是人類用以植物遺傳改良和發展農業生產的物質基礎，是生物多樣性和生態系統多樣性的基礎，也是農業生產中必不可少的繁殖材料。植物育種工作離不開種質資源的定期繁育復壯。種質資源種類繁多，特征特性各異，保護、開發利用種質資源關系到人類的生存條件和經濟條件。一方面常規的種質資源收集、保存、研究和利用，需要建立保護圃或保護地，不僅需要大量的人力、基礎設施和技術路線研究，而且容易遭受自然災害威脅、病蟲害侵襲，造成有益種質資源的丟失；另一方面，科研單位缺乏種質資源保護配套設施，保存的數量有限，時間短，也容易丟失。據報道，若要保存800個品種的葡萄種質，需占土地1 hm2，養護費用十分高昂。植物組織與細胞培養所用的試驗材料取材少，利用不同外植體培養結合低溫、超低溫冷凍貯藏可保存種質資源，保存和繁殖所需的空間比田間栽培要小得多，生長周期短且繁殖系數大，培養效果好，病蟲害少，便于種質資源的交換和轉移。如將葡萄莖段經組培形成的組培苗保存在試管中，溫度調控在9 ℃以下，植株就會停止生長，每年只需轉管1次，這樣800個葡萄品種，每個品種6個重復，只占用2 m2。許多植物都可采用這樣的試管繁殖方式，低溫保存，每年轉接1～2次，就可長期保存，也可以隨時把培養物轉移到常溫的條件下，利用組織與細胞培養技術，將其進行快速繁殖并廣泛應用。

2 優良品種快繁及脫毒

利用組織與細胞培養技術可以進行工廠化生產，實現優良品種的快速繁殖，得到無病毒植株。由于脫毒苗能較好保持原有的優良性狀，植物快繁及脫毒已成為解決病毒病危害和品種退化的一個新途徑。植物組織與細胞經初代及繼代培養獲得完整的植株，遺傳性穩定，突出特點是在短時間內獲得數量龐大的新株系；因此，對一些繁殖系數低、不能用種子繁殖的植物，這項技術是實現商品化生產的最佳途徑，比常用方法繁殖的速度快數百萬倍，是植物組培快繁技術應用在生產實踐上最廣泛、成效最大的實例。1960年Morel提出離體無性繁殖蘭花的方法。Seeni等[1]在火焰蘭的葉基部成功誘導出嫩芽，獲得再生植株。Chang等[2]以寒蘭根狀莖為材料經培養獲得再生植株。

用于組織與細胞培養快繁的植物種類繁多，包括花卉觀賞植物（草本、喬木、灌木和藤本）、經濟作物（蔬菜、果樹、大田作物）及藥用植物（鴨腳樹、人參、紅豆杉等）。脫毒苗可以提高產品的質量與產量，目前國際上無病毒苗木研究機構有：國際熱帶農業研究中心（IITA）、國際馬鈴薯研究中心（CIP）、亞洲蔬菜研究中心（AYRDC）。自1978年以來，美國、新西蘭、荷蘭等國家已經開始用不同樹木的組培苗進行小面積造林，1983年我國的林木組培苗研究已從實驗室走向工廠化大生產、走向市場。離體快繁的特點是培養條件可以人為控制，生長周期短，經濟高效，管理方便，利于工廠化生產和自動化控制。對于名優特植物、常規繁殖容易但易感染病毒的植物、雜合型園藝植物、有性不親和與不育的基因型植物等，離體快繁是一個有效的手段，并將帶來巨大的經濟效益[3]。

農業生產中，許多無性繁殖植物，如馬鈴薯、甘薯、草莓、大蒜等都帶有病毒，根據病毒在植株中分布不均勻，但在植株生長點附近細胞的病毒濃度很低且病毒的含量隨植株部位和年齡而異的原理，通過莖尖分生組織培養或結合其他處理，再生植株可有效脫除病毒，獲得脫病毒小苗。馬鈴薯的脫毒培養是莖尖培養最成功的案例之一。目前，生產上培育并已成功應用的無病毒植株有馬鈴薯、甘薯、大蒜、草莓、甘蔗、菠蘿、香蕉等，一般草莓脫毒苗可以提高20%～50%的產量，并且果個大、形好、畸形果少、口味好[4]。外植體已不僅限于莖尖，未成熟或成熟的胚、葉（花）原基、單個游離細胞、原生質體等都可以應用這一培養技術。

3 誘發和離體篩選突變體

細胞和組織培養是擴大變異的有效途徑，誘發和離體篩選突變體技術是一種高效的種質資源創新方法，為抗逆育種提供了新思路。利用細胞和組織培養中培養的細胞易受培養條件和誘變因素（如射線、化學物質、脅迫處理等）的影響而發生變異的原理，進行突變的誘發，進而從中篩選出有用的突變體，最終育成新品種。大量試驗表明，利用離體篩選技術獲得的突變體在創新抗性材料方面發揮了重要作用。目前，已篩選出的抗性突變體類型有：抗煙草花葉病毒（TMV）和抗除草劑的番茄，抗馬鈴薯X病毒（PVX）和馬鈴薯Y病毒（PVY）的馬鈴薯，辣椒、番茄、亞麻等抗寒突變體，番茄、棉花等耐鹽突變體，茄子抗線蟲、螨蟲和黃萎病突變體，甘藍型油菜抗Basta除草劑和抗菜蛾害蟲等多種變異類型。一些作物離體培養期間體細胞無性系變異頻率高達10%～15%，從中可獲得大量有價值的突變體材料，經過定向選育及抗性鑒定，篩選出一定的目標性狀，得到新種質變異體[4]。與誘變育種相比，誘發和離體篩選突變體技術具有變異頻率高、育種周期短、育種方向性強等優越性，已成為細胞工程領域的研究熱點，用來實現作物品種改良，獲得更多有價值的抗病種質材料，在基因資源等方面的應用將會更加廣泛。

4 克服遠緣雜交困難

植物組織與細胞培養和遠緣雜交相結合是克服遠緣雜交育種中雜種夭亡、雜種后代中間類型不穩定等困難的有效途徑。試管授粉受精和幼胚培養作為解決種間、屬間等遠緣雜交中雜種胚停止發育和雜種F1不結實等問題的手段，克服了常規有性的遠緣雜交雜種后代分離時間長、穩定慢的缺點，在很多種植物上獲得了成功。Laibach培養亞麻種間雜交幼胚獲得成功并得到了雜種，證明胚培養在植物遠緣雜交上可利用，從而開創了植物胚胎培養的應用。

常規育種中雜交不親和是很大的障礙，胚胎在發育初期就出現障礙并停止發育，導致很難進一步生長發育形成幼苗，但通過胚珠培養或子房培養，可促進原胚繼續胚性生長，使幼胚發育成熟，挽救瀕臨中途敗育的雜種胚，獲得遠緣雜種植株，也是進行種子發育機理等方面研究的一個有效方法，為試管受精提供一項基礎技術。1996年，用桃的胚培養成功克服了雜種胚敗育的問題；甜菜（野生種×栽培種）后代雜種胚離體培養誘導得到再生植株，為野生甜菜資源潛力的發掘利用開辟了新的途徑[5]。植物組織與細胞培養在遠緣雜交育種中顯著地擴大和豐富了植物育種的基因庫，改良了栽培品種的品質，合成了新的物種，為研究物種的進化提供了試驗依據。龜谷和日向用蕓薹類植物胚珠培養得到了雜種植物，我國西北生物研究所進行的小麥雌蕊離體授粉和煙草胚珠試管受精試驗均獲得了成功。

5 單倍體育種

植物花藥培養與花粉培養可獲得純系材料進行單倍體育種，克服遠緣雜種的不育性及雜種分離；對于異花授粉植物，可快速獲得自交系，提高育種效率。通過花藥或花粉培養發育成的單倍體植株，經過染色體加倍獲得純合二倍體材料進行植物遺傳規律研究，可減少育種的盲目性，在短期內育成遺傳變異穩定的具有優良性狀的個體。自1964年Guha等獲得曼陀羅的花粉單倍體植株以來，通過花藥或花粉培養的單倍體育種技術，已經作為一種嶄新的育種手段應用于煙草、水稻、小麥、玉米、辣椒、草莓、蘋果以及許多藥用植物如枸杞、人參、平貝母中[6]。Raina等通過茄子花藥培養最早獲得茄子雙單倍體；1974年我國育成了世界上第一個單倍體作物新品種——單育1號煙草品種；Eber等通過培養甘藍型油菜單倍體植株的小孢子獲得非整倍體植株。

對于花藥培養誘導率過低和雄性不育的植物，在人工控制的條件下誘導大孢子或卵細胞增殖，形成單倍體植株。目前，單倍體植株的獲得主要是對花粉或花藥和未受精的子房和胚珠進行離體培養[7-9]。試驗證明，甜菜未授粉胚珠培養比花藥培養誘導率高，西葫蘆單核期的花藥和當日開花未受精的子房愈傷組織誘導率最高，洋蔥開花前3～5 d的子房誘導頻率最高且有很高的遺傳穩定性。朱至清設計N6花藥培養基，不僅在國內得到推廣，而且在國外也被采用。此外，花粉植株的性狀變異率較胚珠培養獲得的單倍體植株高，在禾本科植物中，花粉植株試管苗玻璃化率較高，而子房和胚珠培養獲得的單倍體植株試管苗玻璃化率較低。

6 基因工程的基礎技術

植物分子遺傳學的研究離不開組織與細胞培養技術手段，轉基因技術克服了植物育種中的盲目性，快速有效地創造遺傳變異，是實現植物改良、增加產量和改善品質的一項新技術。通過根癌農桿菌介導法，可獲得生根率達80%以上的甘藍型油菜抗性再生植株；N P TⅡ基因、抗蟲基因都已成功導入茄子。近年來，植物組織與細胞培養技術廣泛應用于大田作物、蔬菜、林木、花卉、禾本科牧草、藥用植物的抗性及單性結實等方面，目前已有100余種植物成功獲得轉基因植株，如利用基因轉換得到茄子的單性果實，利用農桿菌介導法提高紫花苜蓿中縮合單寧的含量，大白菜抗生素潮霉素和抑菌抗生素特美汀轉基因植株的獲得，組織培養體系和遺傳轉化體系改良馬鈴薯品質的建立，轉基因抗除草劑大豆、延熟番茄等的產業化。

愈傷組織遺傳轉化體系的建立為目的基因導入及次生代謝產物生物合成的研究奠定了基礎。1990年，我國自行研制的抗煙草花葉病毒煙草在遼寧進行商品化種植，成為世界上第一例商品化生產的轉基因植株。雖然對轉基因生物及產品存在一定的質疑，但基因工程技術在面臨資源匱乏、糧食短缺等全球性問題上突顯了巨大潛力，賦予傳統植物新的特性，提高植物的抗性、產量及品質，有利于植物的大面積種植和保護，且產生了一定的經濟效益和社會效益。在發展基因工程過程中，轉基因產品的安全性也應受到重視，應該建立一套科學的安全性評價體系和判斷標準，在保證安全性的前提下，保護和促進我國農產品貿易和農業生物技術產業的發展，促進轉基因技術在植物研究和應用領域健康、可持續發展。

7 小結

綜上所述，植物組織與細胞培養技術近年來得到了廣泛的關注和發展。目前，已擴展到植物生長學、生理學、胚胎學、細胞學、遺傳學、病理學等領域。特別是近20年來，植物組織培養不僅在基礎的理論研究上具有重要價值，而且在實際應用中越來越顯示出其優越性，已成為從實驗室研究到大規模工業化育苗的新技術，廣泛應用于農業、園藝、林業、醫藥等領域。此外，與傳統的優良種質材料的繁殖和保存、突變體的誘導和篩選等方法相比，該技術在時間和空間上具有更大的優勢。總之，植物組織與細胞培養技術將深入到人們的生產、生活、科研等各個領域，并將得到不斷提高。