胰腺β細胞再生研究進展

洪育蒲 石喬 王衛星

武漢大學人民醫院普通外科 消化系統疾病湖北省重點實驗室，武漢 430060

【提要】 胰腺由外分泌部和內分泌部組成，包括胰島素在內的多種代謝性激素由胰島的內分泌細胞合成。胰島的再生能力在出生后明顯受限，糖尿病導致的β細胞損傷后需要干預治療來促進β細胞再生修復，目前主要是通過移植人類胰島及人多能干細胞來源的β細胞進行補充；其他方法包括刺激內源性β細胞增殖，促進其他細胞轉化為β細胞，以及從基因工程動物中獲取胰島。

胰腺是控制能量消耗和代謝的核心器官，主要由包括腺泡和導管的外分泌部與胰島為主的內分泌部構成。腺泡細胞產生一系列消化酶，包括脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶，以降解脂肪、蛋白質和碳水化合物。胰島5種內分泌細胞各分泌一種激素，分別為胰島素(β細胞)，胰高血糖素(α細胞)，生長抑素(δ細胞)，胰多肽(PP細胞)和胃饑餓素(ε細胞)。其中胰島素和胰高血糖素直接經過致密的胰島內血管網釋放入血，在維系血糖穩態中起到關鍵作用。在胰腺炎和糖尿病過程中，炎性刺激、高血糖、高血脂以及胰島淀粉樣多肽引起內質網應激和氧化應激，使腺泡細胞與β細胞的結構和功能受損[1-4]。糖尿病是世界上主要的健康問題之一，多種并發癥造成了沉重的社會和經濟負擔。其中以胰島素抵抗為主的2型糖尿病占大多數，研究表明，相對于正常人，2型糖尿病患者存在胰島β細胞數目減少[5]。1型糖尿病是一種自身免疫性疾病，所占比例為5%～10%，患者β細胞選擇性被破壞后導致嚴重的胰島素缺乏，必須依賴于胰島素替代治療。

近幾十年來，糖尿病患者逐年增加，許多研究集中在胰腺發育、穩態和再生領域。在生理狀態下，成人胰腺能否自發再生β細胞仍有待探索。增強或誘導胰島的固有再生能力，發明新方法增加分泌胰島素的β細胞數量對于治療糖尿病有著重要意義。本文就胰腺β細胞再生修復的研究進展作一綜述。

一、胰島再生動物模型

由于糖尿病的重要影響，有關胰腺再生的研究主要集中在胰島再生領域。胰島再生的研究依賴于動物損傷模型，這些模型包括胰腺切除、胰管結扎、胰島細胞化學性損傷等。研究發現，大鼠胰腺切除90%并不影響血糖穩態，提示剩余的胰島以強大的代償能力足以維持血糖水平[6]，而在未成年的嚙齒類動物胰腺切除后，觀察到在切口處發生組織再生。然而，人的胰腺切除50%～60%將誘發胰島素依賴型糖尿病[7]。僅有少數兒童行胰腺切除后發生了組織再生，胰腺再生能力隨著增齡急劇下降，成年后胰腺再生能力消失[8]。

另一種動物損傷模型是胰管結扎后模擬梗阻性胰腺炎，這種模型造成小鼠腺泡細胞廣泛死亡，但是胰島并未受損，也未見明顯的胰島再生[9]。此外，應用鏈佐菌霉素或四氧嘧啶作為化學性毒素制備模型，結構性模擬葡萄糖進入成年動物β細胞并選擇性破壞部分或全部的β細胞。盡管在這些動物損傷模型中也未見β細胞再生[10]，但是在妊娠、肥胖或者胰島素抵抗情況下可以觀察到胰島增生[11-12]。

二、新生胰腺β細胞的方法

鑒于糖尿病患者數量眾多，對β細胞再生治療有著巨大的臨床需求。修復有功能的β細胞群，使得患者免于每日注射胰島素，有助于減少因胰島素劑量控制不佳導致的嚴重并發癥。由于1型糖尿病主要集中在青少年，β細胞的嚴重缺乏引起的血糖異常可能危及生命，對于β細胞再生治療的需求尤為迫切[13]。

尸體來源的胰島移植使得1型糖尿病患者獲益，并有部分患者維持多年無需胰島素替代治療[14]。然而，由于合適的供體來源有限以及需要長期進行免疫抑制治療，尸體來源的胰島移植范圍受限。為了讓更多的患者受益，擁有可靠的標準化的人工胰島以供移植之用，又不需免疫抑制治療是最佳選擇。另外，通過干預治療刺激內源性的β細胞再生也是不錯的選擇。

1．促進干細胞分化：有研究在成年動物和人類胰管及其周圍觀察到單個β細胞和小胰島的存在，提示成年的動物或者人類胰腺存在著干細胞或祖細胞[15]。此外，在胰管結扎的小鼠導管結構中觀察到少量的神經元素3陽性的內分泌前體細胞[16]，并在α細胞向β細胞轉化模型中也觀察到胰島和導管周圍有神經元素3陽性細胞存在[17]。

在對青蛙、魚類及小鼠這些動物幼年時期的研究中已經獲知從受精卵到成熟胰島發育過程涉及的關鍵步驟和信號通路[18-19]。從體細胞中誘導多能干細胞(iPSCs)實現突破，為產生患者所需要的特殊細胞群提供了新思路[20]。從人胚胎干細胞中獲得胰腺內分泌細胞，需首先用信號分子引導人胚胎干細胞定向分化，然后依次形成終末內胚層、胰腺上皮、內分泌祖細胞和胰島素陽性細胞[21]。誘導方案進行優化后，在體外成功促使人胚胎干細胞、iPSCs及胰十二指腸同源盒1(PDX1)陽性的祖細胞分化成對葡萄糖敏感的胰島細胞群，這些細胞群在形態和功能上與胰島相似，并在體內進一步成熟，對小鼠糖尿病模型起到治療作用[22-24]。在體外培養獲得包括β細胞和其他內分泌細胞的細胞群，如果能夠進一步獲得含有血管內皮細胞和成纖維樣細胞的細胞群，將更接近天然胰島。

盡管目前在干細胞研究中取得了顯著的進展，在促進干細胞分化成熟、減少雜質細胞、避免排斥反應等方面仍需繼續探索。

2．β細胞自我復制：刺激β細胞增殖是簡單而直觀的補充β細胞群的方式。大量的生長因子和促有絲分裂物質被證實能促進動物的β細胞增殖，包括甲狀旁腺激素相關蛋白、肝細胞生長因子、胰高血糖素樣多肽、胰島素樣生長因子、胃泌素、表皮生長因子、血小板源性生長因子以及腺苷酸激酶抑制劑等[11-12,25-26]，但是這些物質并不能有效刺激人β細胞增殖。生理情況下，β細胞再生能力隨著增齡顯著降低，在年輕的嚙齒類動物中β細胞維持著較高的增殖率，在1月齡大鼠中每天大約是4%，七月齡大鼠僅為0.5%[27]。人β細胞的大量增殖存在于幼年時期，特別是出生后1年內[28-30]。在正常、妊娠、肥胖成人的胰腺標本中很少檢測到β細胞復制的現象[31-32]。

人和小鼠的胰島存在著結構和分子水平上的差別。小鼠的β細胞主要集中在胰島中央，而人類的β細胞在胰島中均勻分布。人類的β細胞以葡萄糖轉運蛋白1(GLUT1)和GLUT2作為主要的葡萄糖轉運子，而且表達肌腱膜纖維肉瘤癌基因同系物B(MAFB)這種在小鼠β細胞中不表達的因子[33-34]。盡管人β細胞存在控制細胞周期必需的分子元件(細胞周期蛋白、細胞周期蛋白依賴性激酶等)，但是在妊娠、肥胖和胰島素抵抗狀態下，人β細胞并不能像小鼠或大鼠的β細胞那樣發生增殖。通過直接調節上述分子元件或者基因突變可以促使體外培養的人類β細胞進行增殖[35-36]。另外，許多細胞周期因子被限制在成熟β細胞的胞質中，無法轉移到胞核內啟動細胞分裂程序[37]。在肥胖或胰島素抵抗時升高的血清胰島素和葡萄糖可能刺激β細胞增殖[38-39]，但具體的關鍵信號仍不清楚。多項研究通過化合物高通量篩查發現，雙特異性酪氨酸磷酸化調節激酶1A( DYRK1A)抑制劑可以有效刺激體外培養的人β細胞和體內移植的人β細胞進行增殖[40-42]。此外，包括鈣調磷酸酶和絲氨酸蛋白酶抑制劑B1在內的相關通路也被發現[43-44]。但是這些化合物的應用大多伴隨著其他細胞的增殖，在細胞類型特異性、靶向干預胰島等方面仍需進一步論證，以保證這些化合物作用于細胞周期過程中不會誘發腫瘤形成。

3．其他細胞向β細胞轉化：體細胞核移植為重新編程每個細胞成為其他類型細胞提供了可能[45]。相應地，應用β細胞發育的主要調節因子促使非β細胞轉化為胰島素陽性細胞引起了研究者極大的興趣。將神經元素3、PDX1、肌腱膜纖維肉瘤癌基因同系物A(MAFA)三者組合的腺病毒載體導入到成年小鼠胰腺中可以有效促使腺泡細胞轉化為胰島素陽性細胞[46-47]，由此產生的胰島素陽性細胞能維持長時間的穩定性并改善糖尿病。腸道上皮細胞和胃竇細胞也可以轉化為胰島素陽性細胞[48]。另外，神經元素3陽性的小腸內分泌祖細胞條件性敲除叉頭框轉錄因子(FOXO1)后也形成了胰島素陽性細胞[49]。這些研究提示胃腸道上皮細胞通過重新編程可能成為功能性β細胞的來源。還有細胞因子調節的腺泡細胞[50]、FBW7(F-box and WD repeat domain-containing 7)敲除的導管細胞[51]及轉錄生長因子β誘導因子2(TGIF2)過表達的肝細胞[52]亦可轉化為胰島素陽性細胞。

胰島周圍有獨特的胰島素陽性細胞群被認為是α細胞向β細胞的過渡狀態[53]。γ-氨基丁酸(GABA)可以促進α細胞向β細胞轉化，長期的GABA處理有利于增加β細胞群數量[17]。將包含PDX1和MAFA表達組件的腺病毒載體導入體外培養的小鼠和人類胰島中，可以觀察到α細胞向β細胞轉化[54]。多項研究表明，包括腺泡細胞、導管細胞、膽囊細胞及小腸細胞在內的多種細胞可轉化為胰島素陽性細胞，但并不能形成穩定的移植體，可能與不完全轉化或者表觀遺傳不穩定有關[55-56]。基于這些問題，將重編程方法應用到臨床的主要挑戰就是如何優化編程方案來形成穩定而有功能的移植體。

4．基因工程動物獲取胰島：有關以豬胰島為主的胰島異種器官移植方面的探索性研究已經進行了數十年[57]。異種移植物的免疫排斥反應和大量的豬逆轉錄病毒明顯阻礙了移植的成功。有研究應用CRISPR-Cas9基因編輯技術將62個已知的豬逆轉錄病毒從皮膚細胞中敲除，并將這類皮膚細胞制成iPSCs，制備豬胰島移植供體[58-59]。為保持豬來源胰島的長期存活和正常發揮功能，依賴于包裹技術的進步以保護移植物免受人體免疫排斥。

5．促進β細胞再分化： 長期的高血糖和高血脂環境、慢性胰腺炎或胰腺癌導致的胰腺炎性環境及自身免疫性炎癥等應激狀態均可導致胰腺β細功能失調，發生β細胞脫顆粒，甚至基因表達下調。β細胞去分化后將表達胰島祖細胞標記物神經元素3[60]。目前，功能失調的β細胞是否普遍存在去分化，去分化過程在人類β細胞中是否可逆，均尚不清楚。在2型糖尿病患者通過飲食、運動、胰島素強化治療可以促使功能失調的β細胞恢復胰島素分泌能力。那么，尋找促使去分化β細胞發生再分化的藥物將成為糖尿病新的治療方式，并作為一種不產生新細胞的獨特的細胞再生方式。

三、細胞再生治療面臨的挑戰

為了保護尸體來源的β細胞移植物發揮功能，受體可以應用免疫抑制藥物減少排斥反應，但是不可避免地對β細胞產生不良反應。另外一種方法是應用生物工程材料制成微囊包裹移植的β細胞，將β細胞與免疫細胞隔離，但是這也不可避免地將其與血管隔離，并改變了β細胞對葡萄糖的敏感性及對氧和營養物質的利用，對β細胞的長期生存和發揮功能將產生不利影響。為解決這些問題，一系列創新型材料被研發出來[61-62]。此外，在非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠模型中，多種免疫療法被證實可以改善甚至完全阻止免疫攻擊[63]，但是在臨床試驗中，這些方案并不能使患者從中獲益。通過基因修飾胰島細胞群或者操縱受體的免疫系統等方法可能成為減輕免疫攻擊的另一途徑。

那么，獲得天然免疫耐受的β細胞移植物將是未來研究的方向。在長期1型糖尿病的患者胰島中意外發現有β細胞仍表達胰島素，并對葡萄糖刺激敏感，提示這些細胞可能逃避了自身免疫攻擊而繼續發揮生理功能[64]。最近研究發現，正常的小鼠和人類胰島β細胞在分子和功能方面均存在著異質性，并分為多個亞群[65-66]，其中存在著作為啟動胰島素脈沖式釋放的起搏中心的β細胞亞群。針對人胰島標本的深入研究，可以更深刻地認識人β細胞的異質性，以期獲得可以逃避自身免疫攻擊的β細胞。此外，來源于iPSCs的患者特異性細胞群可能是解決免疫排斥和增加免疫相容性的有效手段。

四、小結與展望

基于胰腺胚胎發育及生理和病理狀態下胰腺再生反應的研究，制定胰腺β細胞再生策略將有著重要的指導意義。例如對胚胎發育過程中胰島形成的研究有助于促使人胚胎干細胞分化為胰島細胞群；對出生后胰島從不成熟過渡到成熟狀態的深入了解，將有助于在體外培育成熟的β細胞；探索調控肥胖和胰島素抵抗時胰島細胞群生理性增殖的信號通路，有助于研發促進β細胞增殖而避免癌變風險的藥物。單細胞分析將為研究正常和病理情況下的胰島細胞異質性、尋找免疫耐受的少數內分泌細胞、明確人胚胎干細胞如何過渡到成熟β細胞、以及非β細胞轉化為β細胞等提供新的線索。在單細胞水平的活細胞成像技術將使得體內固有胰島的鈣離子波、胰島素釋放及免疫相互作用可視化。

近年來雖然在胰腺再生方面有著顯著進步，但是仍有一些問題亟待闡明。人類胰腺自然再生和修復的機制如何？在功能性和免疫性方面，胰腺β細胞的異質性有何表現？厘清這些問題，將為未來研制出具有天然抵抗或者逃避自身免疫攻擊特性、無需材料包裹或者免疫抑制藥物的β細胞移植物奠定基礎。這不僅將使得糖尿病患者獲益，也將為其他自身免疫性疾病患者的治療提供新思路。

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