患者來源腫瘤異種移植模型的建立與應用

傅佳琦 滕理送 王浩浩

癌癥是一種高度異質性的疾病，其特征是多種遺傳損傷和信號通路異常。盡管新型治療方法不斷發(fā)展，但對于腫瘤晚期患者來說，如何解決化療耐藥性和延長總生存期仍然是重大挑戰(zhàn)，迫切需要更有效的治療方法。臨床前模型是從對疾病的生物學理解到開發(fā)新的治療方法過程中的重要組成部分。通過人類惡性腫瘤細胞系建立的異種移植模型是抗腫瘤藥物研發(fā)中常用的體外平臺[1]，這種臨床前模型方便易用，在研究導致腫瘤發(fā)生的分子事件中具有重要價值，但在臨床前藥物的開發(fā)上有著明顯的局限性。例如在長期離體培養(yǎng)過程中，細胞會發(fā)生一系列重大和不可逆的生物學特性改變[2]。為克服這些限制，一種更先進的腫瘤模型即患者來源異種移植（PDX）模型應運而生：將患者的腫瘤組織標本直接移植到免疫缺陷小鼠體內，在沒有離體培養(yǎng)的情況下進行傳代。與離體培養(yǎng)細胞相比保留了更多的原發(fā)腫瘤特征，在篩選藥物、鑒定生物標志物、個性化治療研究中有重要的應用價值，現(xiàn)綜述如下。

1 PDX模型的建立和驗證

建立PDX模型需要將患者腫瘤組織或細胞直接植入于免疫缺陷小鼠體內，免疫抑制更嚴重的小鼠如非肥胖糖尿病/重度聯(lián)合免疫缺陷（NOD/SCID）或NOD/SCID/IL-2λ受體缺失（NSG）小鼠植入率較高[3]，更適合生成PDX模型。PDX模型可分為異位植入和原位植入兩類。異位植入是指將腫瘤碎片或單細胞懸液植入與原始腫瘤部位無關的區(qū)域，通常是皮下或腎包膜下，該植入方法簡單、監(jiān)測腫瘤大小更準確，特別適用于需要在短時間內大量移植的情況。此外，也可將患者腫瘤組織移植到與原始腫瘤相同的器官內，即患者來源原位異種移植（PDOX）模型，其優(yōu)勢在于腫瘤可以在相同的解剖微環(huán)境中生長，但操作過程復雜，費用更高。建立模型通常需要2～4個月，若6個月仍未觀察到腫瘤生長，則表示移植失敗[4]。將從患者體內獲取的腫瘤組織切成1～2mm3大小的碎片，置于冷凍培養(yǎng)基中保存。接受腫瘤碎片的第一代小鼠通常表示為F0或G0，當腫瘤達到足夠的大小時，將其解剖并重新植入其他小鼠體內。此后的每一代被命名為 F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3…Fn 或 G1，G2，G3…Gn。為避免PDX模型在傳代過程中與原始腫瘤產生分化，通常第三代（即F3或G3）被用于藥物療效評估[5]。當移植腫瘤達到一定大小（直徑1～2cm）時便可將周圍正常組織一并切除，經10%甲醛溶液固定，石蠟包埋后切片行HE或免疫組化染色，以便驗證其組織學是否與原發(fā)腫瘤一致。從冷凍組織中提取腫瘤DNA、RNA、蛋白質可用于全基因組測序、特定基因及蛋白質表達的檢測。

模型的移植成功率受到腫瘤的組織學亞型、侵襲性特征和植入部位等多種因素的影響。例如，在乳腺癌中，三陰性乳腺癌的移植成功率高于其他組織學類型[6]。此外，轉移性腫瘤比原發(fā)性腫瘤移植成功率更高[7]。由于腎包膜保留了原始腫瘤基質和等效的宿主基質，腎包膜內植入的成功率要高于皮下植入[8]。值得注意的是，腫瘤標本對宿主環(huán)境的適應能力不同于原發(fā)腫瘤，若能適應環(huán)境而不產生免疫排斥反應，則更有可能成功。

2 PDX模型在腫瘤研究中的應用

2.1 PDX模型的特征 目前已成功建立乳腺癌[9]、胃癌[10]、結直腸癌[11-12]、卵巢癌[13-14]、肺癌[15-16]、頭頸部鱗狀細胞癌[17]、膠質母細胞瘤[18]、黑色素瘤[19]等多種惡性腫瘤的PDX模型，這些模型可在沒有離體培養(yǎng)的情況下進行傳代，腫瘤細胞生長在類似于患者原發(fā)腫瘤部位的氧、營養(yǎng)和激素水平的微環(huán)境中，因而可保留其供體腫瘤的大部分組織病理學、生物學、遺傳學特征和表觀遺傳異常等關鍵特征。例如，結直腸癌的PDX模型保存了原發(fā)腫瘤的組織病理學特征、基因拷貝數(shù)變異率，并檢測到與原發(fā)腫瘤相一致的KRAS、NRAS、BRAF和PI3K突變狀態(tài)，且在傳代后保持穩(wěn)定[11]。有研究比較不同傳代的頭頸部鱗狀細胞癌PDX模型對西妥昔單抗治療的敏感性反應，結果表明幾代間保持穩(wěn)定的應答[17]。其次，PDX模型在藥物療效、生物標志物分析的研究中表現(xiàn)出與原代腫瘤相似的結果，顯示出較高的預測能力，進一步體現(xiàn)其在腫瘤研究中的價值。

2.2 藥物篩選和生物標志物開發(fā) 抗癌藥物開發(fā)的主要問題之一是新藥成功率低，僅5%的臨床前抗癌藥物最終被批準用于臨床治療[20]。這可能與篩選新藥物的傳統(tǒng)臨床前模型的預測價值低和缺乏合適的用于選擇患者和監(jiān)測治療反應的生物標志物有關。PDX模型的應用可能改變這一現(xiàn)狀。

越來越多的證據表明，無論是靶向藥物還是經典細胞毒藥物，PDX模型的藥物應答率與臨床結果相近。例如，對BRAF V600E突變型結直腸癌PDX模型進行分析，評估選擇性BRAF抑制劑達布拉非尼與選擇性MEK抑制劑曲美替尼聯(lián)合治療的療效，結果與提供腫瘤標本的患者數(shù)據一致[12]。又如，化療相關研究中也顯示出PDX模型與臨床相一致的反應率[21]。此外，PDX模型還可作為潛在的臨床藥物篩選平臺。在PDX模型中，二甲雙胍無法抑制胰腺癌生長，同樣，臨床試驗也表明在局部晚期和轉移性胰腺癌的聯(lián)合治療方案中加入二甲雙胍沒有任何益處[22]。提示腫瘤患者對藥物的陰性臨床結果也可通過PDX模型來預測，從而節(jié)省臨床試驗所需的時間和資源。

除確定潛在的臨床適應證外，PDX模型還有助于鑒定潛在的生物標志物。在乳腺癌PDX模型中，黏附分子nectin-4可作為原發(fā)性和轉移性三陰性乳腺癌的特異性有效治療靶點，同時也可作為新的乳腺癌預后不良標志物[9]。藥物敏感性和耐藥性的生物標志物可能有助于設計聯(lián)合臨床試驗。在膠質母細胞瘤PDX模型中，DNA修復基因甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉移酶（MGMT）啟動子超甲基化可顯著提高替莫唑胺對膠質母細胞瘤的療效，被用作評價替莫唑胺和聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（PARP）抑制劑維利帕尼（veliparib）聯(lián)合治療膠質母細胞瘤的生物標志物[18]，已納入Ⅱ/Ⅲ期臨床試驗。在BRAF V600E突變型黑色素瘤PDX模型中，發(fā)現(xiàn)多種類似于應用BRAF抑制劑治療過程中的臨床數(shù)據中所確定的耐藥途徑，而MEK抑制劑的加入可克服其對單藥BRAF抑制劑產生耐藥性[19]。基于這些數(shù)據，PDX模型可在藥物研究中發(fā)揮重要作用，以幫助選擇最可能對新藥物敏感的患者群體，確定合適的生物標志物，以便納入臨床研究。

2.3 PDOX模型對于惡性腫瘤轉移研究的應用價值 研究表明，大多數(shù)人實體瘤在裸鼠皮下植入后不會發(fā)生轉移，而PDOX模型可以重現(xiàn)原發(fā)腫瘤的局部侵襲性生長和轉移行為，比PDX模型更好地再現(xiàn)人類腫瘤行為[23]，通常用于建立轉移性腫瘤模型，包括將原發(fā)腫瘤碎片原位移植等待移植瘤生長產生自發(fā)轉移[23]，或將轉移灶直接作原位移植[24]。

PDOX模型中生長的原發(fā)腫瘤和轉移性腫瘤藥物敏感性可能不同，這在皮下移植腫瘤模型中是無法檢測到的。例如，HER-2陽性宮頸癌的裸鼠皮下PDX模型和PDOX模型對苯甲酰胺組蛋白脫乳糖酶抑制劑eninostat均不敏感，但在PDOX模型中觀察到該藥與對照組相比明顯降低了轉移性腫瘤的負荷[25]。PDOX模型通過保留腫瘤的微環(huán)境，更好地反映腫瘤轉移的生物學過程，可用于基質在腫瘤治療過程中的作用、腫瘤轉移的機制、轉移性腫瘤藥物反應等相關臨床研究[26]，對惡性腫瘤轉移的精準治療具有重要意義。盡管如此，PDOX模型仍然相對罕見，可能是因為缺乏器官特異性移植所需的精細顯微外科手術以及合適的用于監(jiān)測腫瘤進展的影像學技術，未來需要進一步研究。

2.4 共臨床試驗 為實時整合和分析小鼠模型與患者之間的信息，研究者提出“共臨床試驗（co-clinical trial）”的概念[27]。該試驗是指臨床前試驗與臨床試驗同時進行，對相關的臨床、生物學和藥理學信息進行全面分析并進行整合，以確定對特定治療反應的預測生物標志物。這些研究在最初是將基因工程小鼠模型對藥物的結果應用到臨床試驗，并在急性早幼粒細胞白血病的治療中得到驗證[27]。目前，PDX模型已經被用于臨床試驗的平行研究中，以研究藥物應答與耐藥機制、研發(fā)提高藥物療效和抗耐藥的治療策略以及篩選預后生物標志物。Kim等[15]的一項共同臨床試驗中，PDX模型忠實復制了肺鱗狀細胞癌患者對多激酶抑制劑多維替尼(dovitinib)的臨床反應，并確定FGFR基因的表達是預測肺鱗狀細胞癌對該藥療效的敏感性生物標志物。共臨床試驗不僅是為了預測正在進行的人類臨床試驗的結果，而且也是為了產生能夠為人類研究的分析和設計提供依據的臨床相關假設。例如，Owonikoko等[16]的一項研究三氧化二砷治療復發(fā)性小細胞肺癌的療效的試驗中，PDX模型與Ⅱ期臨床試驗中的結果相一致。這些研究支持在患者接受臨床試驗前使用PDX模型預先篩選有前途的抗癌藥物，以節(jié)省藥物開發(fā)的時間，取得更有效的臨床成果。

2.5 個性化治療 腫瘤被認為是一種由遺傳變異累積而引起和驅動的疾病，幾乎每種腫瘤都有其獨特的分子變化。個性化PDX模型即Avatar小鼠模型已被用于個性化的癌癥治療[28]。其理論基礎來自于腫瘤患者對治療方案的不同敏感性以及上述PDX模型中藥物應答與臨床反應之間存在的顯著相關性[13-14]。研究人員對晚期實體腫瘤患者進行外顯子測序，通過建立Avatar模型來鑒定腫瘤的藥物靶點并篩選藥物，并為每例患者確定最佳的治療方案[28]。當基因組分析提供的信息較少或靶向途徑失敗時，Avatar模型有助于選擇更多的常規(guī)藥物及藥物組合。盡管在效率、速度和成本方面存在局限性，但目前的數(shù)據支持使用個性化腫瘤移植模型作為治療決策的研究平臺。

3 PDX模型的局限性

近年來，PDX模型因其獨特性在癌癥研究領域取得了重要進展，但仍存在一些局限性。第一，模型建立時間較長，限制了在預計生存期較短的患者中的應用。Mini-PDX模型提供了一種有效的替代方案，將原始腫瘤標本以腫瘤細胞懸液的形式轉移到洗滌膠囊中并埋于裸鼠皮下組織內，只需7d就可以完成藥物敏感性測試[29]。第二，小部分PDX模型與原代腫瘤組織存在分化差異[10]。此外，連續(xù)傳代過程中，小鼠基質逐漸取代人類基質，可能導致腫瘤旁分泌調節(jié)和間質壓力等物理性質的改變，繼而限制與腫瘤微環(huán)境相關藥物的研究[30]。第三，模型長期保存比較困難，需要建立有效的長期冷凍保存條件以及提高后續(xù)再移植效率。已有研究表明特殊冷凍保護劑顯示出較傳統(tǒng)介質更優(yōu)越的性能，可縮短腫瘤形成時間和收獲時間，將再生移植率提高近3倍，即使是超過3年的長期冷凍儲存也能成功地再移植，并可將模型因低溫保存而丟失的潛在風險減少4倍[31]。這一領域的未來研究應該致力于確定安全可靠的冷凍保存時間的上限。第四，模型易受微生物感染。淋巴增生性病變的高發(fā)生率是由于動物模型的免疫缺陷性質引起的，多與EB病毒感染相關[7]。移植瘤被淋巴增生性病變取代，兩者大體外觀上很難區(qū)分，因此，在傳代之前檢查移植物的組織學非常重要。第五，由于小鼠的免疫缺陷性質，傳統(tǒng)的PDX模型不適用于疫苗和檢查點阻斷抗體等免疫調節(jié)劑的篩選。人源化小鼠模型[26]或基因工程小鼠模型可以作為一種替代選擇。第六，PDX模型藥效評價系統(tǒng)有待完善。在治療過程中腫瘤生長遲緩通常會導致腫瘤體積在終點大于治療前而小于對照，雖然這很可能表明治療是具有生物活性的，但這并不意味著該療法在臨床上有效；事實上，這種反應在臨床上被定義為“疾病進展”，甚至是“疾病穩(wěn)定”[26]，需要使用定量指標對反應進行分類以便更精確地評估試驗中的治療效果。有研究者提出改良評價標準[32]，將反應速度、強度和持久性相結合，進一步統(tǒng)一解讀治療反應。第七，雖然PDX模型具有上述多種優(yōu)點，但建立和維持該類模型為基礎的腫瘤精準醫(yī)學需要高成本和大量人力資源，這就需要充足的后勤保障，目前已創(chuàng)建和實施共享包括歐洲EurOPDX資源、美國國家癌癥研究所（NCI）的患者模型存儲庫、異種移植公共存儲庫（PRoXe）等大規(guī)模PDX模型平臺[26]，這些多機構平臺依賴于共同的、經過廣泛測試的操作程序，得到大量資金的支持，確保了可擴展、同質和可重復的實驗方案。

4 小結

總之，PDX模型保留了患者腫瘤的基本特征，在腫瘤研究領域中有重要用途。這一模型在藥物篩選、生物標志物，共臨床試驗中具有許多優(yōu)勢，可作為制定個性化醫(yī)療策略的臨床前研究工具。此外，PDOX模型對于惡性腫瘤轉移研究具有價值。然而，目前仍有一些關鍵問題需要解決，設法提高模型移植成功率、加快生成速度、完善長期保存條件、減少微生物感染、完善藥效評價系統(tǒng)、提高在基質及免疫系統(tǒng)相關研究方面的應用等有助于發(fā)揮其巨大的發(fā)展?jié)摿Γ蔀榕R床腫瘤學研究領域的主流模式。