高通量測(cè)序技術(shù)的研究進(jìn)展

李妍 綜述；徐興祥 審校

（1.大連醫(yī)科大學(xué) 研究生院，遼寧 大連 116044；2.江蘇省蘇北人民醫(yī)院 呼吸科，江蘇 揚(yáng)州 225001）

1 二代測(cè)序技術(shù)的誕生

二代測(cè)序技術(shù)是在過(guò)去十年中不斷發(fā)展起來(lái)的測(cè)序技術(shù)[1]。在20世紀(jì)70年代，Sanger等[2]和Maxam與Gilbert[3]分別開(kāi)發(fā)了通過(guò)鏈終止和斷裂技術(shù)對(duì)DNA進(jìn)行測(cè)序的方法。這種生物轉(zhuǎn)化是通過(guò)提供破譯完整基因以及后來(lái)整個(gè)基因組的工具來(lái)實(shí)現(xiàn)。由于Sanger及其同事開(kāi)發(fā)的技術(shù)，通常被稱(chēng)為Sanger測(cè)序，與Maxam和Gilbert的方法相比，對(duì)有毒化學(xué)品和放射性同位素的處理要求較少，因此它成為未來(lái)30年內(nèi)更為普遍應(yīng)用的DNA測(cè)序方法。隨著對(duì)測(cè)序通量需求的不斷增加，促進(jìn)了實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化和測(cè)序流程的并行化，最終導(dǎo)致大量的測(cè)序儀器批量式生產(chǎn)，由于這些進(jìn)步，Sanger技術(shù)最終在2004年實(shí)現(xiàn)了第一個(gè)人類(lèi)基因組測(cè)序的完成[4]。然而，人類(lèi)基因組計(jì)劃（Human Genome Project,HGP）的完成需要大量的時(shí)間和資源，顯然我們需要更快，更高通量和更經(jīng)濟(jì)的測(cè)序技術(shù)。因此，在2004年，國(guó)家人類(lèi)基因組研究所（National Human Genome Research Institute,NHGRI）發(fā)起了一項(xiàng)資助計(jì)劃，目標(biāo)是在十年內(nèi)將人類(lèi)基因組測(cè)序的成本降低到1000美元[5]，這刺激了二代測(cè)序技術(shù)的開(kāi)發(fā)和商業(yè)化。新的測(cè)序技術(shù)主要有三個(gè)方面的改進(jìn)[6]：首先，它們不依賴(lài)于細(xì)菌DNA片段的克隆，而是依賴(lài)于非細(xì)胞系統(tǒng)中二代測(cè)序技術(shù)（next-generation sequencing,NGS）文庫(kù)的制備。其次，并行產(chǎn)生數(shù)千至數(shù)百萬(wàn)個(gè)測(cè)序反應(yīng)，而不是通常的數(shù)百個(gè)。第三，無(wú)需電泳即可直接檢測(cè)到測(cè)序輸出，整個(gè)過(guò)程是循環(huán)和并行進(jìn)行的。NGS產(chǎn)生的大量讀數(shù)能夠以前所未有的速度對(duì)整個(gè)基因組進(jìn)行測(cè)序。這些重大改進(jìn)使科學(xué)家能夠在很短的時(shí)間內(nèi)以低成本處理整個(gè)基因組的測(cè)序，開(kāi)辟了基因組學(xué)和分子生物學(xué)的新時(shí)代。

從1977年第一代DNA測(cè)序技術(shù)（Sanger法），發(fā)展至今三十多年時(shí)間，測(cè)序技術(shù)已取得了相當(dāng)大的發(fā)展，從第一代到第三代乃至第四代，測(cè)序讀長(zhǎng)從長(zhǎng)到短，再?gòu)亩痰介L(zhǎng)，不斷經(jīng)歷著重大變革的同時(shí)也取得了技術(shù)上不斷的進(jìn)步。目前，第二代測(cè)序技術(shù)在全球測(cè)序市場(chǎng)上已占據(jù)絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)第三和第四代測(cè)序技術(shù)也初露鋒芒。測(cè)序技術(shù)每一次變革，都對(duì)基因組研究，疾病醫(yī)療研究，藥物研發(fā)，育種等領(lǐng)域產(chǎn)生巨大的推動(dòng)作用。

2 根據(jù)NGS平臺(tái)不同分類(lèi)

二代測(cè)序技術(shù)的原理包括合成法測(cè)序及連接法測(cè)序。目前高通量測(cè)序的主要平臺(tái)代表有羅氏公司（Roche）的454測(cè)序儀（Roch GS FLX sequencer），Illumina公司的Solexa基因組分析儀（Illumina Genome Analyzer）和ABI的SOLiD測(cè)序儀（ABI SOLiD sequencer）。

2.1 454焦磷酸測(cè)序

羅氏454是第一個(gè)商業(yè)上成功的下一代測(cè)序系統(tǒng)。使用焦磷酸測(cè)序繼續(xù)，而非雙脫氧核苷酸來(lái)終止鏈擴(kuò)增，焦磷酸測(cè)序技術(shù)依賴(lài)于核苷酸摻入期間釋放的焦磷酸的檢測(cè)。羅氏公司的454焦磷酸測(cè)序技術(shù)原理為：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶的作用下，將每一個(gè)脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleotide triphosphate,dNTP）的聚合與一次化學(xué)發(fā)光信號(hào)的釋放偶聯(lián)起來(lái)，通過(guò)檢測(cè)化學(xué)發(fā)光信號(hào)的有無(wú)和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)檢測(cè)DNA序列的目的[7]。

該技術(shù)的流程可大致分為以下幾部分，第一步為DNA文庫(kù)制備，即基因組DNA/cDNA利用酶促或機(jī)械方法片段化處理至300～800 bp間，經(jīng)末端修復(fù)與特異性接頭等修飾后變性處理回收單鏈DNA。第二步為乳液聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）[8]：?jiǎn)捂淒NA文庫(kù)被固定在直徑約28 μm的DNA捕獲磁珠上，乳化，形成油包水的混合物，每個(gè)獨(dú)特的片斷在自己的微反應(yīng)器里進(jìn)行獨(dú)立的擴(kuò)增，回收純化。第三步為焦磷酸測(cè)序反應(yīng)：攜帶DNA片段的磁珠被放入一種稱(chēng)作“PicoTiterPlate”（PTP）的平板中供測(cè)序反應(yīng)使用。測(cè)序方法采用焦磷酸測(cè)序法，將一種比PTP板上小孔直徑（約為44 μm）更小的磁珠放入小孔中，啟動(dòng)測(cè)序反應(yīng)。測(cè)序反應(yīng)以磁珠上大量擴(kuò)增出的單鏈DNA為模板，每次反應(yīng)加入一種dNTP進(jìn)行合成反應(yīng)，如果dNTP能與待測(cè)序列配對(duì)，則會(huì)在合成后釋放相同數(shù)量的焦磷酸基團(tuán)，釋放的焦磷酸基團(tuán)會(huì)與反應(yīng)體系中的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）硫酸化學(xué)酶反應(yīng)生成ATP，生成的ATP和熒光素酶共同氧化使測(cè)序反應(yīng)中的熒光素分子并發(fā)出熒光[9]，同時(shí)由PTP板另一側(cè)的電荷耦合器件（charge coupled device,CCD）照相機(jī)記錄，最后通過(guò)計(jì)算機(jī)進(jìn)行光信號(hào)處理而獲得最終的測(cè)序結(jié)果。由于每一種dNTP在反應(yīng)中產(chǎn)生的熒光顏色不同，因此可以根據(jù)熒光的顏色來(lái)判斷被測(cè)分子的序列。反應(yīng)結(jié)束后，游離的dNTP會(huì)在雙磷酸酶的作用下降解ATP，從而導(dǎo)致熒光淬滅，以便使測(cè)序反應(yīng)進(jìn)入下一個(gè)循 環(huán)。

由于454測(cè)序技術(shù)中，每個(gè)測(cè)序反應(yīng)都在PTP板上獨(dú)立的小孔中進(jìn)行，因而能大大降低相互間的干擾和測(cè)序偏差。此技術(shù)讀取長(zhǎng)度最長(zhǎng)，高質(zhì)量的讀長(zhǎng)能達(dá)到400 bp[10]，但通量最低。其主要的錯(cuò)誤來(lái)自于同聚物，當(dāng)測(cè)序遇到序列中存在類(lèi)似于PolyA的多聚核苷酸的情況時(shí)，如TAAAAC序列，即相同的堿基的連續(xù)延伸，其中T和C的讀取沒(méi)有問(wèn)題，但A只記錄了一次光信號(hào)，僅信號(hào)強(qiáng)度與TAC序列的A有所不同，因此同聚物越長(zhǎng)，可能產(chǎn)生的誤差就越大，重復(fù)的堿基個(gè)數(shù)只能通過(guò)熒光強(qiáng)度推測(cè)獲得，堿基個(gè)數(shù)與信號(hào)強(qiáng)度不再成線(xiàn)性關(guān)系，引入插入和缺失的測(cè)序錯(cuò)誤將不可避免，所以在檢測(cè)具有重復(fù)序列的DNA片段時(shí)該測(cè)序方法具有困難。

相對(duì)于Sanger測(cè)序、Solexa和SOLid測(cè)序而言，454焦磷酸測(cè)序可以提供中等的讀長(zhǎng)和適中的價(jià)格，適合從頭測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、基因組結(jié)構(gòu)分析、宏基因組研究等[11]。

2.2 Solexa聚合酶合成測(cè)序

2006年，Solexa發(fā)布了Genome Analyzer（GA）測(cè)序儀,2007年該公司被Illumina收購(gòu)。測(cè)序儀采用合成測(cè)序技術(shù)（sequencing by synthesis,SBS）。該測(cè)序方法的核心技術(shù)是：“DNA簇”和“可逆性末端終止”。具體技術(shù)原理是：將基因組DNA的隨機(jī)片段附著到光學(xué)透明的測(cè)序芯片表面，稱(chēng)為流動(dòng)槽（flow cell），這些DNA片段經(jīng)過(guò)延伸和橋式擴(kuò)增后，在flow cell上形成了數(shù)以?xún)|計(jì)的DNA簇，每個(gè)簇是具有數(shù)千份相同模板的單分子簇。然后利用帶熒光基團(tuán)的四種特殊脫氧核糖核苷酸，通過(guò)可逆性終止的邊合成邊測(cè)序技術(shù)對(duì)待測(cè)的模板DNA進(jìn)行測(cè)序[12]。

該測(cè)序方法具體步驟為，第一步文庫(kù)構(gòu)建：方法同454測(cè)序，不同之處在于讀長(zhǎng)，除特殊需要外，大多數(shù)研究主要是打斷成長(zhǎng)度為200～500 bp的序列片段。第二步為簇的生成：flow cell是用于吸附流動(dòng)DNA片段的槽道，每個(gè)flow cell有8個(gè)管道（channel），每個(gè)channel的表面都附有很多接頭，當(dāng)文庫(kù)建好后，這些文庫(kù)中的DNA在通過(guò)flow cell的時(shí)候會(huì)隨機(jī)附著在flow cell表面的管道上，隨后DNA在其表面進(jìn)行橋式PCR的擴(kuò)增。第三步為橋式PCR擴(kuò)增與變性，進(jìn)行這一過(guò)程的目的在于實(shí)現(xiàn)將堿基的信號(hào)強(qiáng)度放大，以達(dá)到測(cè)序所需的信號(hào)要求。第四步測(cè)序：測(cè)序方法采用邊合成邊測(cè)序的方法。在dNTP被添加到合成鏈上后，所有未使用的游離dNTP和DNA聚合酶會(huì)被洗脫掉。隨后，再加入激發(fā)熒光所需的緩沖液，用激光激發(fā)熒光信號(hào)，并有光學(xué)設(shè)備完成熒光信號(hào)的記錄，最后利用計(jì)算機(jī)分析將光學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化為測(cè)序堿基。這樣熒光信號(hào)記錄完成后，再加入化學(xué)試劑淬滅熒光信號(hào)并去除dNTP 3'-OH保護(hù)基團(tuán)，以便能進(jìn)行下一輪的測(cè)序反應(yīng)。Illumina的這種測(cè)序技術(shù)每次只添加一個(gè)dNTP的特點(diǎn)能夠很好的地解決同聚物長(zhǎng)度的準(zhǔn)確測(cè)量問(wèn)題，它的主要測(cè)序錯(cuò)誤來(lái)源是堿基的替換，目前它的測(cè)序錯(cuò)誤率大致在1%～1.5%之間。Solexa技術(shù)特色突出表現(xiàn)在：①每張測(cè)序芯片有8個(gè)通道，每個(gè)通道可單獨(dú)運(yùn)行一個(gè)樣品，也可把多個(gè)樣品混合在一起檢測(cè)；②一次實(shí)驗(yàn)可讀取大于15億個(gè)堿基/芯片；③可精確讀取重復(fù)序列，如：GGGGGG；④成本低，為傳統(tǒng)方法的1/100；⑤不需要建立文庫(kù)，自動(dòng)化樣品制備，簡(jiǎn)單易行。

Solexa平臺(tái)的應(yīng)用范圍十分廣泛，幾乎覆蓋了目前基因組學(xué)研究的各個(gè)方面，如基因組從頭測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、表達(dá)譜分析、小RNA及非編碼RNA測(cè)序、表觀遺傳學(xué)研究等。此項(xiàng)技術(shù)讀取的片段多，測(cè)序通量高，高度自動(dòng)化，適合大量小片段DNA的測(cè)序。其優(yōu)點(diǎn)在于性?xún)r(jià)比最高，不僅機(jī)器的售價(jià)比其他兩種低，而且運(yùn)行成本也低，在數(shù)據(jù)量相同的情況下，成本只有焦磷酸測(cè)序的 1/10。但局限性在于可逆反應(yīng)時(shí)隨反應(yīng)次數(shù)的增加效率減低、信號(hào)減弱，且讀長(zhǎng)短，從頭測(cè)序具有困難。Solexa的讀長(zhǎng)在100～150 bp之間，適合小RNA鑒定、甲基化和表觀遺傳學(xué)研究。

2.3 SOLiD連接酶測(cè)序

SOLiD由Applied Biosystems于2006年購(gòu)買(mǎi)。測(cè)序儀采用基于連接測(cè)序的雙堿基測(cè)序技術(shù)。該技術(shù)的獨(dú)特之處在于以四色熒光標(biāo)記寡核苷酸的連續(xù)連接合成為基礎(chǔ)，取代了傳統(tǒng)PCR，可對(duì)單拷貝DNA片段進(jìn)行大規(guī)模擴(kuò)增和高通量并行測(cè)序[9]。基本原理是通過(guò)熒光標(biāo)記的8個(gè)堿基單鏈DNA探針與模板配對(duì)連接，發(fā)出不同的熒光信號(hào)，其包含連接位點(diǎn)（第一個(gè)堿基），切割位點(diǎn)（第五個(gè)堿基）和4個(gè)不同的熒光染料（連接到最后一個(gè)堿基）[10]，從而讀取目標(biāo)序列的堿基排列順序。在該方法下，目標(biāo)序列的所有堿基都被讀取了兩遍，因此，該測(cè)序方法最大的優(yōu)勢(shì)就是極高的準(zhǔn)確率。該技術(shù)原理為：用連接法測(cè)序獲得基于“雙堿基編碼原理”的SOLiD顏色編碼序列，隨后的數(shù)據(jù)分析比較原始顏色序列與轉(zhuǎn)換成顏色編碼的reference序列，把SOLiD顏色序列定位到reference上，同時(shí)校正測(cè)序錯(cuò)誤，并可結(jié)合原始顏色序列的質(zhì)量信息發(fā)現(xiàn)潛在單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism,SNP）位點(diǎn)。

測(cè)序技術(shù)流程：第一步同樣為文庫(kù)構(gòu)建，SOLiD系統(tǒng)能支持兩種測(cè)序模板：片段文庫(kù)或配對(duì)末端文庫(kù)，我們通常根據(jù)需要選擇對(duì)應(yīng)的文庫(kù)。片段文庫(kù)多用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、RNA定量、miRNA探索、目標(biāo)（區(qū)域）重測(cè)序（targeted resequencing）、3',5'-RACE、甲基化分析、染色質(zhì)免疫共沉淀（chromatin immuno precipitation，ChIP）測(cè)序等。配對(duì)末端文庫(kù)多用于全基因組測(cè)序（whole genome sequencing,WGS）、SNP分析、結(jié)構(gòu)重排/拷貝數(shù)等研究。第二步為乳液PCR/微珠富集：SOLiD的PCR過(guò)程也和454的方法類(lèi)似，但這些微珠比起454系統(tǒng)來(lái)說(shuō)則要小得多，只有1 μm。與454測(cè)序方法相比，在同一系統(tǒng)中高通量的實(shí)現(xiàn)顯得更為輕松。第三步為連接酶測(cè)序。這一步是SOLiD測(cè)序的獨(dú)特之處，就在于兩個(gè)堿基確定一個(gè)熒光信號(hào)，相當(dāng)于一次能決定兩個(gè)堿基，這種測(cè)序方法也稱(chēng)之為“雙堿基測(cè)序法”。第四步為數(shù)據(jù)分析，SOLiD測(cè)序完成后，得到了由顏色編碼組成的SOLiD原始序列。考慮到堿基與顏色信息的簡(jiǎn)并性，為避免錯(cuò)誤顏色編碼引起后續(xù)的連鎖解碼錯(cuò)誤，SOLiD序列分析軟件不直接將SOLiD原始顏色序列解碼成堿基序列，而是依靠參考（reference）序列進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

SOLiD的讀取長(zhǎng)度最初是35 bp，每次運(yùn)行輸出數(shù)據(jù)量為3 G。由于采用雙堿基測(cè)序方法，過(guò)濾后SOLiD可達(dá)到99.85%的高精度。ABI在2007年底發(fā)布了第一個(gè)SOLiD系統(tǒng)，在2010年末發(fā)布了SOLiD 5500xl測(cè)序系統(tǒng)。從SOLiD到SOLiD 5500xl，ABI在短短三年內(nèi)發(fā)布了五次升級(jí)。SOLiD 5500xl實(shí)現(xiàn)了每次運(yùn)行在讀長(zhǎng)、精確度及輸出量分別為85 bp，99.99%和30 G。一次完整運(yùn)行可在七天內(nèi)完成，目前是第二代測(cè)序技術(shù)中準(zhǔn)確性最高的。并且由于Solid測(cè)序法采用的不是PCR反應(yīng)進(jìn)行DNA合成與測(cè)序，因此對(duì)于高GC含量的樣本具有很大優(yōu)勢(shì)。但在熒光解碼階段，鑒于其是雙堿基確定一個(gè)熒光信號(hào)，因而一旦發(fā)生錯(cuò)誤就容易產(chǎn)生連鎖的解碼錯(cuò)誤。另外，在這三種技術(shù)中該技術(shù)測(cè)序讀長(zhǎng)為50 bp最短，后續(xù)序列拼接同樣比較復(fù)雜，且讀取長(zhǎng)度受反應(yīng)次數(shù)限制，給從頭測(cè)序拼接帶來(lái)困難。因此，我們?cè)谶x擇測(cè)序方法之前應(yīng)權(quán)衡利弊，選擇最合適的測(cè)序方法。該測(cè)序方法常用平臺(tái)為ABI 3730 XL，適于基因組重測(cè)序和單核苷酸多態(tài)性（SNP）檢測(cè)。

3 根據(jù)NGS原材料不同進(jìn)行分類(lèi)

目前，我們可以根據(jù)要解決問(wèn)題的不同使用不同的方法。初始輸入材料可以是基因組DNA（DNA-seq），信使或非編碼RNA（RNA-seq）或特異性獲得的任何核/核糖核酸材料。

3.1 DNA測(cè)序（DNA-Seq）

包括全基因組測(cè)序[13]，全外顯子測(cè)序（whole exome sequencing,WES）[14]和靶向測(cè)序[15]。

WGS允許對(duì)整個(gè)基因組測(cè)序，需要大的DNA樣品，為了準(zhǔn)確地檢測(cè)臨床突變，可能需要100至200倍的測(cè)序覆蓋，即在時(shí)間和成本上具有一定的限制性。通常，采用足以鑒定結(jié)構(gòu)重排的30至60倍測(cè)序。WGS的主要技術(shù)優(yōu)點(diǎn)是文庫(kù)制備不需要任何富集或擴(kuò)增，測(cè)序特異性理論上為100%，在實(shí)踐中實(shí)現(xiàn)約為95%～98%，在整個(gè)輸入材料的感興趣區(qū)域（region of interest,ROI）中具有均勻的覆蓋。日常應(yīng)用WGS最重要的障礙是成本高，數(shù)據(jù)的復(fù)雜通路分析和數(shù)據(jù)解釋。該方法特異度為95%～98%，測(cè)序深度為30～60 x，20 x以上的目標(biāo)區(qū)域占所有目標(biāo)區(qū)域的90%～95%，操作過(guò)程所需時(shí)間為6～24個(gè)小時(shí)[15-17]。

對(duì)于許多應(yīng)用來(lái)說(shuō)，整個(gè)基因組測(cè)序既不實(shí)用也不必要。WES僅對(duì)基因組的編碼區(qū)進(jìn)行測(cè)序，關(guān)注基因組的外顯子，約2.5%的人類(lèi)基因組已發(fā)現(xiàn)與疾病或表型相關(guān)的罕見(jiàn)或常見(jiàn)變體[18-19]。與WGS相比，WES降低了成本和時(shí)間。最常見(jiàn)的方法依賴(lài)于通過(guò)寡核苷酸探針雜交以“捕獲”靶向的DNA片段，從而富集外顯子序列。WES目前已應(yīng)用于識(shí)別與癌癥相關(guān)的基因[20]，糖尿病[21]，免疫疾病[22-23]等。WES文庫(kù)制備/樣本處理最常用的技術(shù)為T(mén)ruSeq，代表了Illumina測(cè)序的最新進(jìn)展，旨在優(yōu)化數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性，研究可擴(kuò)展性和用戶(hù)體驗(yàn)。典型的測(cè)序工作流程包括樣品/文庫(kù)制備，簇?cái)U(kuò)增，DNA測(cè)序，圖像分析/堿基調(diào)用，讀取比對(duì)和變體發(fā)現(xiàn)。通過(guò)TruSeq技術(shù)，該流程中的每個(gè)步驟均經(jīng)過(guò)優(yōu)化，可提供最準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，以確保任何研究項(xiàng)目的最高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。通常，WES測(cè)序的特異度為75%～80%，測(cè)序深度為100～200 x，20 x以上的目標(biāo)區(qū)域占所有目標(biāo)區(qū)域的90%～95%，操作過(guò)程所需時(shí)間為6～72個(gè)小時(shí)。

靶向測(cè)序即測(cè)序集中于針對(duì)特定疾病的目標(biāo)基因。由于靶向測(cè)序技術(shù)聚焦于對(duì)特定疾病ROI的選擇，在節(jié)約時(shí)間和成本方面，對(duì)于更多針對(duì)臨床應(yīng)用研究的實(shí)驗(yàn)室更加準(zhǔn)確和方便。

3.2 RNA測(cè)序（RNA-Seq）

RNA測(cè)序旨在對(duì)選擇性的基因剪接轉(zhuǎn)錄物的發(fā)現(xiàn)、轉(zhuǎn)錄后修飾、基因融合、突變/單核苷酸多態(tài)性（SNP）的檢測(cè)以及小和長(zhǎng)非編碼RNA和基因表達(dá)變化等研究[24]。首先將提取的RNA富集并逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA，然后加工。此外，即使當(dāng)前沒(méi)有可用于診斷的相關(guān)基因測(cè)序板，使用NGS方法，仍然可以對(duì)表觀遺傳學(xué)改變，例如啟動(dòng)子甲基化，微小RNA和其他小RNA的表達(dá)進(jìn)行研究。

早期的RNA-seq研究經(jīng)常使用不保留鏈信息的方案。然而，真核轉(zhuǎn)錄組遠(yuǎn)比我們預(yù)想的復(fù)雜得多，許多基因會(huì)產(chǎn)生反義轉(zhuǎn)錄物[25]。為了應(yīng)對(duì)這種復(fù)雜性，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了許多特異性的RNA-seq方案，其中第一個(gè)出現(xiàn)在2008年[24]。這些方案使得鑒定具有重要生物功能的新型反義調(diào)控轉(zhuǎn)錄物成為可能[26-28]。目前，一些新型的樣品制備方法可允許在單細(xì)胞水平進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)提供了與經(jīng)典方法相比更為詳細(xì)的轉(zhuǎn)錄動(dòng)力學(xué)視圖。例如，來(lái)自對(duì)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的分析顯示，看似相同的細(xì)胞之間可能存在實(shí)質(zhì)的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性[29]。最近發(fā)表的一篇開(kāi)創(chuàng)性研究描述了一種稱(chēng)為熒光原位RNA測(cè)序（fluorescent in situ sequencing,FISSeq）的方法，不僅能夠研究單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組，而且可以確定細(xì)胞內(nèi)每個(gè)轉(zhuǎn)錄物的精確位置[30]。

經(jīng)典RNA-seq僅限于測(cè)量RNA穩(wěn)態(tài)水平，通常不直接反映轉(zhuǎn)錄活性或蛋白質(zhì)合成速率。幾年前，開(kāi)發(fā)了一種在單核苷酸分辨率下通過(guò)特異地測(cè)序新生轉(zhuǎn)錄物使轉(zhuǎn)錄可視化的方法。NET-seq是2011年開(kāi)發(fā)的一種RNA測(cè)量工具，它是提供更高分辨率并保留RNA鏈信息的RNA聚合酶ChIP-seq的替代品。這里提到的ChIP-seq是將染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP）與NGS技術(shù)相結(jié)合的染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序（ChIP-seq），最初被開(kāi)發(fā)用于鑒定體內(nèi)蛋白質(zhì)-DNA相互作用[31]，并已經(jīng)廣泛用于研究生物過(guò)程的多樣性。近年來(lái)，很多的突變都被這種技術(shù)檢測(cè)出來(lái)。

4 討論

雖然，二代測(cè)序的出現(xiàn)為臨床診療提供了一個(gè)嶄新的平臺(tái)和廣闊的前景，包括個(gè)體化癌癥治療和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)等廣泛應(yīng)用[32-34]。然而，實(shí)施NGS的重大挑戰(zhàn)仍然存在，局限性仍然不容忽視。除以上列舉的技術(shù)性局限性之外，數(shù)據(jù)存儲(chǔ)和處理也是NGS面臨的重要挑戰(zhàn)。在未來(lái)幾年，成千上萬(wàn)的新的人類(lèi)基因組將使已經(jīng)令人印象深刻的可用序列數(shù)據(jù)量翻倍。越來(lái)越多的人選擇進(jìn)行基因組測(cè)序，保密成為一個(gè)重要因素。這些信息將如何存儲(chǔ)以及訪(fǎng)問(wèn)權(quán)限，是否可以讓測(cè)序者知道其基因組的每個(gè)細(xì)節(jié)，或只知道與疾病診斷或治療相關(guān)的細(xì)節(jié)，我們?nèi)绾畏乐箍赡艹霈F(xiàn)的“遺傳歧視”，以及道德問(wèn)題等肯定會(huì)隨著個(gè)人基因組的發(fā)展而出現(xiàn)，這些問(wèn)題仍迫切需要解決。此外，以更高效的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)和分析方法來(lái)跟上數(shù)據(jù)生產(chǎn)的增長(zhǎng)速度也有待研究[35]，后續(xù)大量的測(cè)序數(shù)據(jù)分析，以及如何以生物學(xué)知識(shí)去科學(xué)地解釋和實(shí)際應(yīng)用都值得我們進(jìn)一步探索。