神經(jīng)干細(xì)胞移植治療缺血性腦卒中研究進(jìn)展

張敏娜，張一兵綜述，王光輝，鐘 鳴審校

腦血管疾病是全球面臨的首要健康問題，缺血性腦卒(ischemic stroke)中發(fā)病率、致殘率和死亡率一直居高不下。缺血性腦卒的核心病變是致血管內(nèi)部空間變窄時甚至封閉血管，缺氧缺糖 (oxygen-glucose deprivation，OGD)引發(fā)炎性損傷、組織壞死和細(xì)胞凋亡的發(fā)生[1]。溶栓/切除血栓的臨床治療策略由于治療時間窗狹窄難以達(dá)到滿意的治療效果，因此開發(fā)缺血性腦卒中精準(zhǔn)治療新策略勢在必行。近年來研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stem cells,BMCs)等通過增殖分化和遷移、改善受損區(qū)細(xì)胞生存微環(huán)境、重建受損區(qū)域神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)、最大限度的恢復(fù)缺失的神經(jīng)功能[2,3]。近年來干細(xì)胞移植治療腦血管疾病的研究主要集中在神經(jīng)干細(xì)胞聯(lián)合移植、干細(xì)胞納米材料傳遞體構(gòu)建、移植后實時監(jiān)測細(xì)胞增殖、微小RNA(miroRNA)對神經(jīng)干細(xì)胞的調(diào)控和基因修飾后移植神經(jīng)干細(xì)胞等方面， NSCs移植治療缺血性腦卒中的作用和機(jī)制為臨床精準(zhǔn)治療提供有益參考。

1 移植NSCs對缺血性腦卒中治療作用與意義

腦卒中動物模型常用大鼠大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)及缺血再灌注(ischemia-reperfusion injury,I/R)模型，體外擴(kuò)增和移植的方式引入外源性NSCs、BMCs等具有增殖分化能力的干細(xì)胞，也可以激活腦室管膜室下區(qū)SVA和海馬齒狀回顆粒層下區(qū)SGZ的成體干細(xì)胞aNSCs(SVA和SGZ為aNSCs較為集中部位)[4,5]，NSCs以及其神經(jīng)前體細(xì)胞(部分源于BMCs)的誘導(dǎo)激活增殖分化和遷移重構(gòu)神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)為修復(fù)受損腦區(qū)帶來了新的治療前景[6,7]。通過NSCs自我更新、多向分化能力，內(nèi)分泌、抗炎、抗損傷等作用，有利于損失的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的重新構(gòu)建，具體治療作用包括組織修復(fù)(誘導(dǎo)分化形成神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞等)、神經(jīng)突觸重構(gòu)(誘導(dǎo)βIII神經(jīng)微絲蛋白的表達(dá)和延伸)、神經(jīng)內(nèi)分泌(神經(jīng)營養(yǎng)因子)、激活損傷區(qū)域附近存在的NSCs和神經(jīng)前體細(xì)胞、誘導(dǎo)微血管發(fā)生、自噬功能調(diào)節(jié)、外泌體的形成與調(diào)控、維持細(xì)胞增殖內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定等[8,9]。

2 NSCs移植治療缺血性腦卒中研究

2.1 聯(lián)合移植治療 盡管成人神經(jīng)干細(xì)胞原位激活參與修復(fù)發(fā)揮到一定作用，但是距離理想的修復(fù)還有一段很長的研究之路要走，不同類型的干細(xì)胞，如NSCs、BMCs、PC12細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞、以及人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hi-PSC)等衍生的神經(jīng)干細(xì)胞/神經(jīng)祖細(xì)胞作為缺血性卒中的治療的良好儲備細(xì)胞[10,11]。傳統(tǒng)NSCs移植的主要方式包括局部注射、動脈或靜脈注射、腦室腦脊液注射等途徑，各有利弊，近年來NSCs移植方式/方法也在不斷的改進(jìn)和更新，突破了單一種類細(xì)胞移植的局限，尤其是移植方式的改變?nèi)缏?lián)合特定的條件移植、聯(lián)合特殊的細(xì)胞移植、聯(lián)合藥物等移植為移植后細(xì)胞成活創(chuàng)造了良好的條件。胚胎源性NSCs+腦血管內(nèi)皮細(xì)胞共培育后同時移植，借助內(nèi)皮細(xì)胞的分泌作用和周細(xì)胞(pericyte)成血管作用發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)、突觸重塑、調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬功能[12]。NSCs聯(lián)合亞低溫療法(33 ℃)，借助于低溫條件減少細(xì)胞代謝、增加對缺血缺氧損傷的耐受能力，結(jié)果顯示缺血后梗死面積減小伴有炎性損傷明顯減輕[13]。突破血腦屏障是血液途徑移植干細(xì)胞到達(dá)腦區(qū)研究方向，甘露醇聯(lián)合替莫唑胺(Temozolomide)可以改變腦血液滲透壓的同時，增加血腦屏障的通透性，所以NSCs+甘露醇+替莫唑胺靜脈注射到慢性腦卒中動物模型后明顯增加NSCs腦內(nèi)遞送[14]。綜合上述研究，與單純NSCs移植相比，增加病變周圍區(qū)域的溴脫氧尿苷(活躍增殖細(xì)胞聚集區(qū)域)、雙皮質(zhì)素(新生神經(jīng)元所在區(qū)域)和Reca-1陽性細(xì)胞(血管內(nèi)皮細(xì)胞)的表達(dá)，聯(lián)合治療更有助于改善行為缺陷，其機(jī)制可能涉及增加進(jìn)入腦缺血區(qū)干細(xì)胞的數(shù)量、改善神經(jīng)再生和血管生成。

2.2 納米材料作為移植傳遞體的治療 納米顆粒粒徑小(1～100 nm)，表面體積/體積比相對大，有利于細(xì)胞或分子(藥物、抗體)附著，納米技術(shù)提高藥物生物利用度，增加藥物的特異性治療作用，降低了藥物的不良反應(yīng)[15]。納米材料作為NSCs移植的傳遞體，為提高移植后細(xì)胞生存率和改善神經(jīng)功能方面作用突出，磁性納米材料的導(dǎo)入可以在治療中進(jìn)行實時監(jiān)測效果，成為細(xì)胞移植治療的新亮點。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞不良再生能力干細(xì)胞在腦損傷中的治療效果，尤其持續(xù)的炎癥反應(yīng)、缺乏結(jié)構(gòu)支持和營養(yǎng)因子缺乏等因素抑制了細(xì)胞的整合和長期存活。硫酸化糖胺聚糖基聚電解質(zhì)復(fù)合納米顆粒的納米雜化水凝膠可以模擬腦細(xì)胞外基質(zhì)，并控制基質(zhì)衍生因子SDF-1α和bFGF的遞送。bFGF對基質(zhì)金屬蛋白酶的反應(yīng)，用于募集內(nèi)源性NSCs和調(diào)節(jié)其細(xì)胞增殖和發(fā)育。利用PCN表面靜電隔離技術(shù)釋放生物活性因子，體外擴(kuò)增SDF-1α和bFGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以調(diào)節(jié)NSCs。在體內(nèi)缺血性卒中模型中，這些因素通過增強神經(jīng)發(fā)生和血管生成來促進(jìn)神經(jīng)行為恢復(fù)[16]。缺血性腦卒中治療最關(guān)鍵的是恢復(fù)神經(jīng)回路，其中神經(jīng)元功能重建起著中心作用。損傷微環(huán)境中由于髓鞘相關(guān)抑制因子結(jié)合Nogo-66受體(NgR)導(dǎo)致NSCs向神經(jīng)元分化不良，嚴(yán)重影響了治療效果。將鈷超順磁性氧化鐵納米粒子和靶向NgR基因的siRNA編碼入NSCs的納米聚合物，通過沉默NgR基因來指導(dǎo)NSC的神經(jīng)元分化，更有意義的是可以通過磁共振成像實時無創(chuàng)地監(jiān)測NSCs的遷移狀況，集治療與實時監(jiān)測于一體。結(jié)果顯示體外實驗結(jié)果NSCs分化為神經(jīng)元的比例可由3%左右提高到37%左右；體內(nèi)實驗顯示將經(jīng)過鈷超順磁性氧化鐵納米粒子和靶向NgR基因的siRNA編碼入NSCs處理過的神經(jīng)干細(xì)胞直接移植到腦梗死動物模型，神經(jīng)元的比例也可由4%左右(對照組)提高到27%左右(鈷超順磁性氧化鐵納米粒子組)，缺血性腦卒中大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)得到改善[17]。

2.3 基因修飾治療 基因修飾處理后的神經(jīng)干細(xì)胞具有了更強的增殖分化能力和促進(jìn)血管增生改善微環(huán)境作用，缺氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia-inducible factor,HIF)、GDNF、NT-3和bFGF等基因修飾的NSCs移植治療研究取得很大進(jìn)步。HIF在缺氧環(huán)境中參與基因轉(zhuǎn)錄，HIF-1由HIF-1α(120 kD)和HIF-1β(91～94 kD)兩個亞單位組成的異源二聚體。經(jīng)重組腺病毒構(gòu)建AD-HIF-1α載體,感染NSCs后經(jīng)腦室內(nèi)移植進(jìn)入MCAO動物。4 w后HIF-1α的免疫印跡和免疫組化結(jié)果均顯示Nestin陽性移植細(xì)胞以及神經(jīng)元(NSE陽性)和星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP陽性)數(shù)量明顯增加。行為學(xué)檢測結(jié)果標(biāo)明動物運動功能和認(rèn)知功能改善明顯。缺血區(qū)Ⅷ因子陽性細(xì)胞(血管內(nèi)皮細(xì)胞)數(shù)增加，表明HIF-1α的表達(dá)同時促進(jìn)血管生成[18]。

GDNF促進(jìn)軸突再生。GDNF/NSCs更能顯著抑制腦炎癥、提高髓鞘密度的。GDNF/NSCs的存活率明顯高于移植的NSCs。移植的GDNF/NSCs分化成更多的神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞。此外，在大鼠GDNF/神經(jīng)少突膠質(zhì)細(xì)胞mRNA的表達(dá)與大鼠神經(jīng)干細(xì)胞顯著增加[19]。聯(lián)合移植和基因修飾GDNF基因修飾胎鼠中腦外側(cè)區(qū)中腦來源神經(jīng)干細(xì)胞mNSC，培養(yǎng)5 d。與PBS注射和GFP基因修飾的mNSCs移植相比，GDNF基因修飾中腦來源的是神經(jīng)干細(xì)胞mNSCs移植后56 d，大鼠腦內(nèi)移植細(xì)胞數(shù)量增多，移植組檢測到更多分化的多巴胺能神經(jīng)元[20]。改善中腦損傷引發(fā)的退行性改變分子機(jī)制尚需進(jìn)一步闡明。NT-3基因修飾的NSCs聯(lián)合膠原蛋白硫酸肝素支架移植可顯著改善腦出血大鼠運動功能。移植的神經(jīng)干細(xì)胞具有較好的存活、遷移和分化能力[21]。MCAO大鼠腹腔注射改良bFGF基因修飾的C17.2NSCs(5×106/200 μl)于MCAO后第7天和第28天進(jìn)行組織學(xué)分析。C172細(xì)胞在腦內(nèi)的存活、遷移、增殖和分化均得到改善[22]。

3 microRNA在NSCs修復(fù)缺血性腦卒中治療中的調(diào)控作用

microRNA為1993年發(fā)現(xiàn)的一類小分子非編碼RNA(21～25個核苷酸),通過斷裂靶標(biāo)mRNA和抑制翻譯過程參與基因表達(dá)的調(diào)控，轉(zhuǎn)錄過程中與基因的非編碼區(qū)的結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平上抑制基因的表達(dá),另外microRNA為一種作為表觀遺傳因子，參與胚胎發(fā)育過程的時間和空間順序的生物鐘調(diào)節(jié)、細(xì)胞調(diào)亡、各類型干細(xì)胞增殖分裂和分化，神經(jīng)生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)miroRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)高度富集，參與神經(jīng)元分化和突觸形成過程[23,24]。與NSCs及BMCs分化為神經(jīng)細(xì)胞相關(guān)的有miR134、miR145、miR124和miR126在神經(jīng)干細(xì)胞移植治療MACO中的調(diào)控作用也是研究熱點問題。Chi等[25]發(fā)現(xiàn)MACO經(jīng)缺氧缺糖處理后，BMCs miR134水平下降，而incaspase-8水平升高，通過降低caspase-8的表達(dá)和活性而顯著抑制細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)caspase-8小干擾RNA敲除caspase-8可減少少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，實驗結(jié)果表明，源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的神經(jīng)前體細(xì)胞外體通過負(fù)性調(diào)節(jié)caspase-8依賴的凋亡途徑，miR134抑制少突膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡。定量逆轉(zhuǎn)錄酶實時聚合酶鏈反應(yīng)檢測miR145相關(guān)mRNA通路，發(fā)現(xiàn)miR145、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)和p38 mRNA在大鼠NSCs中的表達(dá)呈時間依賴性。Western blot顯示miR145的過度表達(dá)促進(jìn)了NSCs中MAPK通路相關(guān)mRNA和蛋白的表達(dá)，而miR145的表達(dá)抑制了MAPK通路的表達(dá)。miR145在NSCs中的過度表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞周期素D1、巢蛋白、神經(jīng)元特異性烯醇化酶和膠質(zhì)纖維酸性蛋白蛋白的上調(diào)，增強了NSCs的活性，促進(jìn)了細(xì)胞增殖和分化，抑制了細(xì)胞凋亡和裂解caspase-3的表達(dá)。移植后大鼠NSCs過度表達(dá)miR145后，行走能力和神經(jīng)功能恢復(fù)迅速，皮質(zhì)中產(chǎn)生更多神經(jīng)元。miR145通過靶向MAPK通路保護(hù)腦缺血大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的功能[26]。miR 124納米顆粒(NPs)在缺氧缺糖后降低了細(xì)胞死亡并改善了室下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)的神經(jīng)元分化，進(jìn)一步深入研究，換用血栓形成誘導(dǎo)的永久性局灶性腦缺血后立即靜脈注射miR 124納米顆粒在PT后14 d,免疫學(xué)發(fā)現(xiàn)SVZ中5-溴-2’-脫氧尿苷(BrdU)和雙皮質(zhì)素/BrdU陽性細(xì)胞的數(shù)量變化不明顯，即SVZ中神經(jīng)干細(xì)胞/神經(jīng)祖細(xì)胞增殖未見影響。但是miR124NPS能夠在卒中后第2天特異性地增加IL-6水平，起到明顯改善炎性微環(huán)境的作用[27]。相似的研究還發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后miR126在促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞生長增殖的同時,通過負(fù)向調(diào)節(jié)HOXA9表達(dá)提高神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元的分化,從而促進(jìn)小鼠運動功能修復(fù)[28]。血管內(nèi)皮細(xì)胞的生成和調(diào)節(jié)也是一個神經(jīng)組織修復(fù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，表達(dá)miR126的內(nèi)皮前體細(xì)胞(endothelial progenitor cell，EPCs)被注入腦卒中小鼠，微血管密度增加，神經(jīng)功能評分和梗死體積減少，進(jìn)一步研究顯示miR126通過MIR 126/SDF 1/CXCR7信號通路促進(jìn)EPCs的遷移[29]。

4 思考與展望

成年內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的作用可能是以內(nèi)分泌功能調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境為主，增殖分化功能相對較弱，激活信號通路機(jī)制方面有待于進(jìn)一步深入研究。相比之下外源性神經(jīng)干細(xì)胞移植治療前景廣闊，盡管目前存在倫理的問題、免疫排斥反應(yīng)甚至誘發(fā)腦部腫瘤的風(fēng)險等[30]，隨著神經(jīng)干細(xì)胞生存環(huán)境的逐漸改善，特別是近年來基因組學(xué)的研究深入，包括microRNA的調(diào)控作用研究、NSCs基因修飾研究和基因編輯技術(shù)精確調(diào)控基因表達(dá)研究等，加之納米技術(shù)磁共振成像的應(yīng)用實現(xiàn)了對NSCs移植位置及分布實時監(jiān)控和生長發(fā)育動態(tài)的追蹤，為NSCs精準(zhǔn)治療缺血性腦卒中創(chuàng)造了有利的條件。