嗜熱內切葡聚糖酶(E1)植物亞細胞定位表達載體的構建及驗證

李齊東，高 璐，蔣建雄，武艷芳，李 霞，王永麗，劉瑤瑤，孫建中

(江蘇大學環境與安全工程學院，生物質能源研究所，江蘇 鎮江 212013)

農作物秸稈是自然界中儲量豐富的可再生資源，具有來源廣泛、成本低廉等特點。中國秸稈資源十分豐富，每年農作物秸稈的總量約為 6×108～8×108t[1-2]，約占世界秸稈總量的20%[3]。秸稈資源的充分利用，有利于減少秸稈丟棄甚至焚燒帶來的環境污染，降低化石能源消耗，對中國國民經濟的可持續發展具有重要意義[4-6]。木質纖維素是農作物秸稈的主要成分，由纖維素、半纖維素和木質素組成，以分子化學鍵的形式緊密連接，形成天然的抗降解屏障[7]，限制秸稈的降解利用。傳統的木質纖維素利用成本較高，效率有限，而且極易造成二次環境污染，阻滯其產業化的快速發展。

纖維素降解酶在植物中表達重組，能夠減少木質纖維素轉化過程中酶制品的添加量，提高降解酶的作用效率，降低木質纖維素降解的成本，具有重要的應用前景和學術價值。其中，嗜熱纖維素降解酶的活性溫度遠高于植物正常生長的溫度[8]，受到相關科研工作者的廣泛重視。但仍有研究結果[9-10]表明，由于嗜熱纖維素降解酶在常溫下仍有一定活性，在植物中的表達會干擾植物細胞壁組織結構，導致植物抗逆性降低，組織器官坍塌或植株矮化畸形，造成產量下降甚至植株死亡的后果，制約嗜熱纖維素降解酶在作物和能源植物遺傳改良中的應用。

為避免轉基因對植物正常生長的影響，不少研究者采用定向胞外或細胞器積累表達的策略，目的基因產物被限制在特定的器官、亞細胞結構中[11]。亞細胞定位對促進蛋白質表達，明確蛋白質功能具有重要作用[12-13]。利用這一策略能明確嗜熱纖維素降解酶定位表達對植物細胞壁的影響及其對植物秸稈降解的效率，保證植物正常生長，以實現秸稈高效降解利用的目的。

本研究擬在植物不同的亞細胞結構中,對來源于解纖維素熱酸菌(Acidothermuscellulolytics)的嗜熱內切葡聚糖酶基因(E1)進行定位表達。通過農桿菌介導的瞬時表達技術，利用洋蔥表皮和煙草進行目的基因定位研究，在倒置熒光顯微鏡下觀察基因表達產物的亞細胞定位，以期為進一步探索嗜熱內切葡聚糖酶(E1)不同的定位表達在秸稈高效轉化和資源化利用中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 植物材料 本氏煙(Nicotianabenthamiana)由云南省煙草農業科學研究院提供。洋蔥(AlliumcepaL.)購于本地菜市場。

1.1.2 試驗試劑 限制性內切酶(NotI、NcoI、XbaI和SalI)購自NEB有限公司，內質網紅色熒光探針(ER-Traker Red，NO. C1041)購自碧云天生物技術有限公司，線粒體紅色熒光探針(MitoTraker? Deep Red FM，NO. 40741ES50)購自上海翊圣生物科技有限公司，葉綠體紅色熒光染色菌液由江蘇省農業科學研究院提供

1.2 試驗方法

1.2.1E1基因序列優化與合成 利用在線軟件Graphical Codon Usage Analyzer對E1基因的密碼子偏好性進行分析，并根據禾本科模式植物水稻(Oryzasativa)的密碼子偏好性優化E1基因序列，確保每個密碼子的偏好率均高于10%，尤其是N端密碼子的偏好率大于20%。在E1基因的N端和C端分別添加了NcoI和NotI酶切位點。

1.2.2 植物亞細胞定位表達載體的構建 優化后的E1基因經過NotI和NcoI雙酶切，分別與5個不同亞細胞定位信號肽的ImpactVectors載體連接，構建成E1-IV1.1～E1-IV1.5系列載體，其中載體編號1.1表示不含有信號肽，1.2表示通過內質網分泌的胞外信號肽，1.3表示內質網滯留信號肽，1.4表示葉綠體信號肽，1.5表示線粒體信號肽。利用PCR技術將上述載體中信號肽-E1基因序列擴增。根據載體序列設計的PCR擴增引物分別為：正向擴增引物(1.1S)5′-GTCCATTCCTCCTAAGTATCTAGAA-3′，反向擴增引物(1.1A)5′-GCACGCGTCGACGCCGCGCTCGCGGCGCACGCAA-3′，反向擴增引物(1.3A) 5′-GCACGCGTCGACGAAGTTCGTCCTTGTGA-3′(其中下劃橫線部分表示酶切位點，斜體部分表示保護堿基)。將純化后的PCR產物分別雙酶切，然后連接到Cam35S-GFP植物表達載體中，構建表達含有信號肽和E1-GFP融合蛋白質的植物亞細胞器定位表達載體。

1.2.3 農桿菌感受態細胞的制備、轉化 根癌農桿菌(AgrobacteriumtumefaciensEHA105)感受態細胞制備和轉化參照王關林等[14]的方法進行，轉化后在YEB固體選擇培養基(含有50 μg/ml利福平和100 μg/ml卡那霉素)中倒置暗培養48 h，分別挑取轉化的農桿菌單菌落，用材料與方法1.2.2中引物1.1A、1.1S和1.3A進行菌落PCR鑒定。

1.2.4 煙草與洋蔥表皮細胞的轉化及熒光倒置顯微鏡觀察 本研究選用洋蔥和煙草2種試驗材料進行農桿菌介導和亞細胞定位分析。用洋蔥表皮細胞進行細胞質和質外體定位表達分析，采用煙草葉片進行內質網、葉綠體和線粒體定位表達分析。

1.2.4.1 農桿菌介導的洋蔥瞬時表達系統 取無菌的洋蔥表皮切至大小約1 cm2，于固體1/2 MS培養基中28 ℃暗培養24 h后，用含1/2 MS滲透培養基[10 mmol/L MgCl2，10 mmol/L 2-(N-嗎啉)乙磺酸，100 μmol/L乙酰丁香酮]重懸后[13]的重組農桿菌侵染15 min，共培養48 h(25 ℃，32 h光照，16 h黑暗)。將洋蔥表皮細胞清洗干凈，并制片用于熒光倒置顯微鏡觀察。用30%蔗糖溶液浸泡侵染過的洋蔥表皮細胞10 min，使其發生質壁分離，用于質外體表達融合蛋白質的驗證觀察。

1.2.4.2 農桿菌介導的煙草瞬時表達系統 離心重組農桿菌，收集，用1 ml 10 mmol/L的MgCl2重新懸浮洗滌菌體后，離心棄去上清液，采用滲透培養基[13][10 mmol/L MgCl2，10 mmol/L 2-(N-嗎啉)乙磺酸，100 μmol/L乙酰丁香酮]重新懸浮菌體，于25 ℃下避光靜置4 h。選取成熟的煙草葉片，避開葉脈，從下表皮將菌液緩慢均勻地注射入煙草葉片。避光12 h后，培養48 h(溫度25 ℃，光照32 h，黑暗16 h)。亞細胞定位熒光探針于觀察前注射于煙草葉片下表皮，注射后避光30 min，撕取葉片下表皮細胞，制片，用熒光倒置顯微鏡觀察。

2 結果與分析

2.1 E1基因優化

目的基因在異源表達前，通常要進行外源目的基因的優化處理。優化密碼子偏好性分析結果(表1)顯示，7種氨基酸(114處)的密碼子在植物中的相對適應性較低，平均為45%。通過基因優化后，共計改變了150個堿基序列。優化后密碼子序列的平均相對適應性提高到91%，有利于E1基因高效穩定表達。

2.2 植物不同亞細胞定位表達載體的構建和驗證

以帶有不同亞細胞定位信號肽的ImpactVectors系列載體為基礎，成功構建含有信號肽和E1-GFP融合蛋白質的植物亞細胞定位表達載體(圖1)。

表1E1基因優化及密碼子的相對適應性

Table1E1geneoptimizationandcodonrelativeadaptability

氨基酸 密碼子優化前優化后相對適應性(%)優化前優化后氨基酸數量精氨酸CGCCGG20267天冬氨酸GACGAT4710020組氨酸CACCAT641005亮氨酸CTGCTC426516脯氨酸CCGCCT4710031絲氨酸AGCTCT4610018纈氨酸GTCGTT4810017

采用雙酶切技術對ImpactVectors-E1載體進行驗證，用NotI和NcoI 2種限制性核酸內切酶進行雙酶切，酶切產物的瓊脂糖凝膠電泳圖(圖2A)顯示，E1基因的片段大小為1 576 bp，ImpactVectors系列空載體大小約為4 700 bp，經測序,E1基因片段已完全插入到ImpactVectors-E1融合載體中。對雙元植物表達載體E1-IVs-GFP進行PCR擴增驗證(所用引物同材料與方法1.2.2)，瓊脂糖凝膠電泳結果(圖2B)表明，E1基因(帶有不同信號肽基因序列)的片段大小約為1 576 bp，與理論預測結果完全一致。

2.3 亞細胞定位分析

E1基因已插入到Cam35S啟動子和綠色熒光蛋白質基因(GFP)中，形成融合表達載體。為了確定帶有綠色熒光的目的蛋白質是否在細胞中特定部位實現了表達，將融合表達載體利用農桿菌介導法轉化到洋蔥表皮細胞和煙草葉片中，并用熒光倒置顯微鏡進行觀察。

2.3.1E1基因的細胞質定位表達分析 不帶有信號肽的E1融合蛋白質在洋蔥表皮細胞中的定位表達如圖3顯示，熒光倒置顯微鏡觀察發現，不帶有信號肽的E1-IV1.1-GFP表達載體在洋蔥表皮細胞的細胞質中均實現了表達。由于洋蔥表皮細胞中含有液泡，故GFP綠色熒光蛋白質在細胞膜內側近膜區域表達較為充分。

2.3.2E1基因的質外體定位表達分析 帶有分泌表達信號肽的E1融合蛋白質在洋蔥表皮細胞中的定位表達如圖4顯示，熒光倒置顯微鏡觀察發現，帶有分泌表達信號肽的E1-IV1.2-GFP表達載體在洋蔥表皮細胞的細胞壁上實現了表達，與分泌表達信號肽的定位位置完全一致，說明目的蛋白質已分泌至膜外區域。

A：植物表達載體構建流程；B：含有不同信號肽的E1基因結構。Not I、Nco I、Xba I和Sal I均表示限制性核酸內切酶的酶切位點；CaMV35S：35S啟動子；GFP：綠色熒光蛋白基因；LB：left border 載體導入基因片段的左側邊界；RB：right border載體導入基因片段的右側邊界；Kana：抗卡那霉素的基因片段；Amp：抗氨芐青霉素的基因片段；SP：信號肽；SPS：分泌型信號肽；ERR：內質網滯留信號肽；SPC：葉綠體信號肽；RSSUI：Rubisco小亞基蛋白質內含子；SPM：線粒體信號肽。圖1 植物表達載體的構建Fig.1 The construction of plant expression vectors

A: ImpactVectors-E1質粒雙酶切產物瓊脂糖凝膠電泳；B: E1-IVs-GFP質粒PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳。圖2 酶切及PCR產物瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 The enzyme digestion and PCR products agarose gel electrophoresis

A:明場圖；B:綠色熒光圖；C:疊加圖。圖3 不帶有信號肽的E1- GFP融合蛋白質在洋蔥表皮細胞中的定位Fig.3 Localization of E1-GFP fusion protein without signal peptide in onion epidermal cells

A:明場圖；B:綠色熒光圖；C：疊加圖。圖4 帶有分泌表達信號肽的E1-GFP融合蛋白質在洋蔥表皮細胞中的定位Fig.4 Localization of E1-GFP fusion protein with secreted signal peptide in onion epidermal cells

2.3.3E1基因的內質網定位表達分析 帶有內質網定位信號肽的E1融合蛋白質在洋蔥表皮細胞中的定位表達如圖5顯示，將帶有內質網定位蛋白質的E1-IV1.3-GFP表達載體導入煙草葉片中，采用ER-Traker Red內質網紅色熒光探針進行細胞染色。熒光倒置顯微鏡觀察發現，綠色熒光蛋白質的分布范圍與紅色熒光完全一致，表明帶有GFP熒光標記目的蛋白質的主要表達位置是內質網。

A：明場圖；B：綠色熒光圖；C：紅色熒光圖；D：紅色熒光與綠色熒光疊加圖。圖5 帶有內質網表達信號肽的E1-GFP融合蛋白質在洋蔥表皮細胞中的定位Fig.5 Localization of E1-GFP fusion protein with endoplasmic reticulum signal peptide in onion epidermal cells

2.3.4E1基因的葉綠體定位表達分析 帶有葉綠體表達信號肽的E1融合蛋白質在煙草葉肉細胞中的定位表達如圖6顯示，將帶有葉綠體定位信號肽序列的E1-IV1.4-GFP表達載體導入煙草葉片中，采用葉綠體紅色熒光探針進行細胞染色，熒光倒置顯微鏡觀察發現，綠色熒光蛋白質的分布范圍與紅色熒光完全一致，說明帶有GFP熒光標記的目的蛋白質在葉綠體上獲得了充分表達。

A：明場圖；B：綠色熒光圖；C：紅色熒光圖；D：紅色熒光與綠色熒光疊加圖。圖6 帶有葉綠體表達信號肽的E1-GFP融合蛋白質在煙草葉肉細胞中的定位Fig.6 Localization of E1-GFP fusion protein with chloroplast signal peptide in tobacco mesophyll cells

2.3.5E1基因的線粒體定位表達分析 帶有線粒體定位表達信號肽的E1融合蛋白質在煙草葉肉細胞中的定位表達如圖7顯示，將帶有線粒體定位信號肽序列的E1-IV1.5-GFP表達載體導入煙草葉片中，采用MitoTraker線粒體紅色熒光探針進行細胞染色，熒光倒置顯微鏡觀察發現，綠色熒光蛋白質的分布范圍與紅色熒光完全一致，表明帶有GFP熒光標記的目的蛋白質在線粒體上獲得了充分表達。

A：明場圖；B：綠色熒光圖；C：紅色熒光圖；D：紅色熒光與綠色熒光疊加圖。圖7 帶有線粒體表達信號肽的E1-GFP融合蛋白質在煙草葉肉細胞中的定位Fig.7 Localization of E1-GFP fusion protein with mitochondrial signal peptide in tobacco mesophyll cells

3 討 論

植物中木質纖維素的難降解性是生物質能源商業可行性的主要限制因素。近幾年，植物基因工程技術得到了廣泛重視，成為改造能源植物以及促進木質纖維素高效降解的重要手段[15]。E1基因是嗜熱纖維素降解酶基因家族中的關鍵基因[11]，對E1基因亞細胞的定位表達進行研究具有重要意義。相關研究結果[11,16]表明，在實際生產應用過程中，E1蛋白質重組纖維素酶的最適活性溫度在60 ℃以上，其貯存穩定性和熱穩定性均較好。

本研究成功構建了帶有5種不同信號肽編碼序列E1-IVs-GFP系列植物表達載體，并在植物體內實現了不同的亞細胞定位表達。細胞質和細胞間隙是植物細胞生命活動的重要場所[17]。耐高溫纖維素降解酶在玉米細胞的質外體中表達，重組纖維素酶的表達量占可溶性總蛋白質的2.1%，并獲得了845 mU/mg總蛋白質的酶活性，這是迄今為止得到的較高活性[18]。本研究結果為嗜熱內切葡聚糖酶在細胞質和細胞間隙中的蛋白質功能和表達效果研究奠定了基礎。內質網作為重要的植物細胞器，密切參與蛋白質的合成過程，是重要的蛋白質運輸通道。內質網定位信號肽(KDEL)可以使蛋白質從高爾基體回流到內質網，從而使蛋白質定位于內質網中[19]。本研究采用KDEL定位信號，取得了較好的內質網定位效果。線粒體與細胞呼吸、細胞凋亡[20]等關系密切，某些蛋白質通過破壞細胞線粒體的功能從而影響植物的正常生長[21]，因此關于線粒體的研究是嗜熱內切葡聚糖酶對植物生長發育影響研究的重要組成部分。本研究利用酵母菌CoxIV分泌信號在線粒體基質中傳遞蛋白質[22]，將目的蛋白質與酵母CoxIV信號肽的前4個氨基酸融合，以保證目的蛋白質的正確定位。葉綠體是植物細胞進行光合作用的細胞器，是植物進行糖類合成的重要場所，在植物的生長發育過程中起著不可替代的作用。導入葉綠體的外源基因必須在適當調控蛋白質[23]的控制下才能在葉綠體中表達，本研究利用菊花小亞基蛋白質的分泌信號將蛋白質輸送到葉綠體基質中，與Rubisco蛋白質的前11個氨基酸融合，確保信號肽的正確加工。

本研究結果表明，E1-GFP融合蛋白質集中分布在信號肽所對應的細胞器內，在細胞質和線粒體中表達熒光強度較高，具有較好的表達效果。以上研究結果為E1基因在植物中的不同亞細胞定位表達及植物木質纖維素的高效降解利用提供了理論依據和研究基礎。