鴨骨骼肌TNNI1基因CpG島區甲基化與mRNA差異表達

姬改革，束婧婷，單艷菊，章 明，屠云潔，巨曉軍，劉一帆

(江蘇省家禽科學研究所，江蘇 揚州 225125)

在肌肉的收縮過程中，肌鈣蛋白(Troponin I ，TnI)是重要的調節因子，定位于橫紋肌，能夠和肌動蛋白結合，抑制肌球蛋白ATP酶的活性，使肌肉保持松弛的狀態。TnI基因包含3種亞型[1]，分別為慢速骨骼肌型肌鈣蛋白或肌鈣蛋白I 1基因(TNNI1)；快速骨骼肌型肌鈣蛋白I(Fast skeletal muscle troponin I)或肌鈣蛋白I 2基因(TNNI2)和心肌型肌鈣蛋白 I( Cardiac troponin I)或肌鈣蛋白I 3基因(TNNI3)。TNNI1和TNNI2在發育的早期，肌肉生成過程中可以相互轉換，共同表達，之后分別被限制在慢和快肌纖維中表達[2-3]。TNNI3在心肌的表達具有特異性[4-5]。

骨骼肌肌纖維類型是影響肌肉品質的重要因素，通常認為慢肌比例較高的肉品質相對較好。在哺乳動物上的研究結果表明[6]，TNNI1基因在成年動物慢肌纖維中特異性的表達，在肉品質和脂肪沉積方面具有重要的作用。在雞上[7]，有研究者發現TNNI1基因在蛋雞肌肉中的表達量顯著高于肉雞。關于TNNI1的研究多集中在哺乳動物，家禽方面相關的研究較少。課題組前期研究發現，TNNI1基因可能在鴨肌肉發育中具有重要的作用。在人上的研究發現[8]，與肌纖維類型相關的MYH7B、MYH7、MYH8、MYH3等基因的CpG位點的甲基化程度在快收縮型肌纖維和慢收縮性肌纖維上具有顯著差異。DNA甲基化是指在DNA序列沒有發生改變的情況下，相應的基因表達發生改變，導致可遺傳的表型變化。通常由DNA甲基化轉移酶催化，將 S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基轉移到胞嘧啶第5位C上，形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)。基因啟動子區在基因轉錄調控中具有重要作用,因此了解基因啟動子區CpG位點在不同組織中的甲基化程度，有助于揭示基因在不同組織差異表達的調控機理。本研究擬采用染色體步移技術克隆鴨TNNI1基因啟動子區序列，采用生物信息學方法分析其序列特征，采用熒光定量PCR技術檢測TNNI1基因在不同類型肌肉(胸肌和腿肌)組織中的差異表達情況，采用BSP技術檢測基因啟動子區DNA甲基化水平差異，以期為進一步探討鴨TNNI1基因在肌肉發育中的轉錄調控機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

所用試驗動物高郵鴨來自江蘇省高郵鴨集團種鴨群，隨機選取健康的處于上市日齡(70日齡)的高郵鴨公母各5只。放血屠宰后，分離胸肌和腿肌組織，立即放入液氮速凍，然后轉入-80 ℃冰箱保存。用于核酸的提取。

1.2 試劑

DNA提取試劑盒、pGM-T克隆試劑盒、SuperReal熒光定量試劑盒、QuantScript RT Kit購自天根生化科技有限公司，染色體步移試劑盒Genome Walking kit、TaqMax、DL2000 Marker均購自TaKaRa公司，EpiTect? Bisulfite kit購自Qiagen公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒Gel Extraction kit、質粒小提試劑盒plasmid Mini Kit購自中美泰和公司。DH5α感受態細胞為本實驗室保存。

1.3 試驗方法

1.3.1 基因5′側翼區的克隆 按照DNA提取試劑盒的說明書，提取高郵鴨胸肌肌肉組織DNA。因鴨TNNI1基因DNA序列(NCBI登錄號：NW_004676592.1)信息尚不完善，存在多個GAP區域，采用染色體步移的方法進行TNNI1基因5′側翼區的克隆。染色體步移采用TaKaRa公司的染色體步移試劑盒，按照試劑盒的說明書進行。

首先需要對已知序列進行驗證。根據鴨TNNI1基因序列(NCBI登錄號：NW_004676592.1)，在TNNI1基因的CDS區設計引物P1，以基因組DNA為模板，進行PCR擴增。用1 %瓊脂糖凝膠對PCR產物進行電泳檢測，并將擴增片段連接到pGM-T載體，鑒定為陽性的克隆送上海生工生物工程技術服務有限公司進行序列測定。獲得的序列比對正確后，設計2條特異性引物SP1、SP2，進行下一步的延伸。以設計的2條特異性引物SP1、SP2和試劑盒提供的通用引物進行熱不對稱PCR反應。反應體系和條件參照說明書。以鴨基因組DNA為模板進行第一輪PCR反應，引物為SP1和試劑盒中的通用引物AP1～AP4，試驗特異性反應的溫度為65 ℃，延伸時間為3 min。第一輪反應的PCR產物稀釋10倍后，作為第二輪PCR反應的模板進行第二輪PCR反應，引物為SP2和試劑盒中的通用引物AP1～AP4。分別取2輪PCR反應的產物5 μl，用1%瓊脂糖凝膠對PCR產物進行電泳檢測，選擇清晰的電泳條帶進行膠回收純化，將回收純化的DNA連接至pGEM-T載體，轉化DH5α感受態細胞，挑取陽性克隆于含氨芐抗性的LB液體培養基中，振蕩培養過夜，進行PCR鑒定。將鑒定正確的質粒送上海生工生物工程技術服務有限公司進行序列測定。本試驗所用的引物見表1。

表1鴨基因PCR擴增引物

Table1PrimersforduckTNNI1genePCR

引物名稱 引物序列 (5'→3') 片段長度(bp)用途P1-FCGAAGCCACGATGCCAGAG1 094染色體步移P1-RGAGCTGGCTCAGGGACSP1CTCACCCACACCTCCCTGC2 239染色體步移SP2ACAGGGGTCTCGAGCACT2 192染色體步移TNNI1-FCTGCACGAGAAGGTTGAG109熒光定量檢測TNNI1-RGCAGGTCAAGCACTTTGATβ-actin-FCAAATGCTTCTAAACCG-GAC151熒光定量檢測β-actin-RAACCTTCACCATTC-CAGTTTTBSP-FTGTATATAAGAGGGGATTTGT-GT324甲基化引物BSP-RACTTCTCCCCAAAC-CTCTCT

1.3.2 序列分析 采用在線軟件BDGP(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)預測核心啟動子區；利用在線軟件AliBaba (http://www.gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html?)進行啟動子區轉錄因子結合位點分析；利用在線軟件MethPrimer(http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)預測基因啟動子區CpG島。

1.3.3 CpG島甲基化水平檢測 提取高郵鴨胸肌和腿肌組織DNA，測定濃度后，取500 ng DNA，用亞硫酸鹽對DNA進行處理，樣本DNA未發生甲基化的胞嘧啶(C)被轉化為尿嘧啶(U)，經PCR擴增最終變為胸腺嘧啶(T)，而甲基化的胞嘧啶則不變。處理的DNA純化后，以此DNA為模板，進行BSP-PCR擴增反應。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶，鑒定正確后，將BSP-PCR產物與T載體連接，轉化感受態細胞DH5α后，涂板，隨機挑取單克隆，用PCR法進行鑒定，鑒定為陽性菌的進行測序，每個轉化板至少挑10個陽性克隆，用BiQ_Analyzer分析軟件對DNA序列和測序序列進行比對，判斷CpG位點是否發生甲基化，統計分析各個位點的甲基化程度。

1.3.4 熒光定量PCR檢測 Trizol法提取高郵鴨胸肌和腿肌組織總RNA，瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測質量和濃度。檢測合格后，取2 μg總RNA，反轉錄為cDNA。以管家基因β-肌動蛋白基因(β-actin)為內參，檢測TNNI1基因的相對表達量。熒光定量PCR擴增采用SYBR Green I法，反應總體積20.0 μl，反應體系如下：2×SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10.0 μl，上下游引物各0.4 μl(10 μmol/L)，cDNA模板2.0 μl，50×Rox Reference Dye 0.4 μl，加ddH2O 6.8 μl補足20.0 μl。反應條件為：95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 60 s，共35個循環；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s。每次反應均設空白樣品為陰性對照，每個樣品設置3個重復。相對定量的結果采用2-△△Ct法進行處理。

1.4 數據分析

運用SPSS 20.0軟件中的t檢驗和Bivariate Correlation進行差異顯著性檢驗和相關性分析。所有數據均以“均值±標準差”表示。

2 結 果

2.1 鴨基因5′側翼區擴增

根據染色體步移試劑盒的說明，首先要對編碼區已知序列進行驗證。以鴨基因組DNA為模板，以P1為引物，進行PCR擴增，擴增得到1條特異性條帶，如圖1，結果與預測片段大小相一致，與引物源序列(NW_004676592.1)一致性為99%，說明驗證的已知序列正確，可以據此已知序列設計特異性引物進行側翼序列的擴增。分別以根據已知序列設計的特異性引物SP1和SP2和試劑盒中的通用引物AP1～AP4進行2輪熱不對稱PCR反應，第二輪PCR有清晰的條帶(圖1)，切膠回收，并進行測序。

M：DNA 分子量標準，DL2000；1：CDS區已知序列擴增結果；2：5′側翼區序列擴增結果。圖1 鴨基因5′側翼區PCR擴增Fig.1 PCR products of duck TNNI1 gene 5′ flanking sequence

2.2 生物信息學分析

經NCBI BLAST比對，獲得的5′側翼區序列片段長度為2 078 bp，與鴨(NW-004676592.1)TNNI1基因啟動子序列同源性達97%，表明所擴增序列來源正確。使用在線軟件BDGP對啟動子核心區域進行預測，結果發現該序列存在4處的核心區域(表2)，其中最有可能的核心啟動子區是核心區1，而核心區1和核心區2，核心區2和核心區3之間存在區域重疊現象，灰色背景的堿基代表轉錄起始位點。

表2鴨基因核心啟動子區域預測

Table2PredictionofcorepromoterregionofduckTNNI1gene

核心區起始位點終止位點分值啟動子序列(5'→3')1-1 916-1 8660.99GCCTGTGGTTTAATACTCCCCCTCCGCCGCCGGGCCCCGCAGT-GCGCGGC2-1 890-1 8400.80 CCGCCGGGCCCCGCAGTGCGCGGCTCCGCTGACACCAGGCACCAC-CGAGG3-1 858- 18080.83 CACCAGGCACCACCGAGGTAAGAGGGGGCCCGGCCCCGGCTGT-GCTGCGG4-529-4790.90 TTGGGGTTGTTTAAAATGTTTCCCAAATTCGTGGGGATGCAAAAGGTTGA

斜體的堿基代表轉錄起始位點。

使用在線AliBaba 2.1程序，搜素 TRANSFAC 4.0 數據庫，對獲得的TNNI1基因5′側翼區序列進行分析，發現多個Sp1(Specificity Protein 1)結合位點，CCAAT增強子結合蛋白(CCAAT/enhancer binding proteins, C/EBPs)結合位點。還預測到了E-box、SP1、八聚體結合蛋白-1 (Octamer binding protein-1，Oct-1)、核因子KB (Nuclear Factor-kB，NF-KB)、GATA1(GATA binding protein 1)、生肌調節因子MRF4(Myogenic regulatory factor 4)等轉錄因子結合位點。經在線軟件Methprimer 對啟動子區CpG進行預測(Criteria used: Island size>100， GC Percent>50.0，Obs/Exp>0.6)，結果顯示,在-2 032至-1 833處存在1個200 bp的CpG島，在-206至-87處存在1個120 bp的CpG島(圖2)。預測的啟動子核心區1、核心區2、核心區3位于-2 032至-1 833處的CpG島內，其中部分CpG位點正好位于預測的核心啟動子區內。對CpG島(-2 032～-1 833 bp)進行分析(圖3)，發現其存在3個Sp1結合位點，1個CCAAT增強子結合蛋白(C/EBPs)結合位點，同時發現轉錄因子如維甲類X受體β(Retinoid X receptor beta，RXR-beta)、叉頭框轉錄因子M1 (forkhead box M1，HNF-3)、NF-KB、c-Myc(Transcriptional regulator Myc-like)等的結合位點。

圖2 鴨基因5′側翼序列CpG島預測結果Fig.2 Prediction of CpG island in duck TNNI1 gene 5′ flanking sequence

數字代表核苷酸位置(以ATG為+1)，加粗字體和加方框的序列代表預測的轉錄因子及其結合位點，下劃線代表預測的核心啟動子位置，灰色背景序列為BSP檢測的CpG位點，順序依次為1～14。圖3 鴨基因5′側翼區CpG島轉錄因子結合位點預測結果Fig.3 Prediction of transcription factor binding sites in duck TNNI1 gene 5′ flanking sequence CpG island

2.3 高郵鴨基因表達水平

高郵鴨胸肌和腿肌組織TNNI1基因 mRNA 表達水平如圖4所示，腿肌組織TNNI1基因表達量顯著高于胸肌近9倍，二者差異極顯著(P<0.01)。

**表示胸肌和腿肌組織基因表達差異極顯著(P < 0.01)。圖4 鴨胸肌和腿肌組織TNNI1 mRNA表達情況Fig.4 The mRNA expression of TNNI1 in the breast and leg muscles of ducks

2.4 DNA甲基化分析

鴨TNNI1基因啟動子區BSP擴增序列位于-1 964 bp至-1 641 bp區域內，全長序列為324 bp，包含整個預測的核心啟動子區，共有14個CpG位點。從圖5A中可以看出，總體上，胸肌的甲基化水平為52.66%，腿肌的甲基化水平為57.04%，二者差異不顯著(P>0.05)。比較各CpG位點的甲基化水平，從圖5B中可以看出，胸肌和腿肌各個CpG位點的甲基化水平在胸肌和腿肌中均無顯著差異(P>0.05)。啟動子區各CpG位點的甲基化水平與TNNI1基因的mRNA 表達量進行相關性分析，結果如表3所示，胸肌中CpG2、CpG6、CpG7、CpG11、CpG12、CpG13、CpG14與腿肌中CpG4、CpG5、CpG6、CpG7、CpG8、CpG10、CpG11、CpG12位點的甲基化水平與mRNA表達量均呈正相關(P>0.05)，其余各位點甲基化水平與mRNA 表達量呈負相關(P>0.05)；其中，胸肌CpG4甲基化程度與mRNA表達量呈顯著負相關(P<0.05)。

3 討 論

課題組前期通過RNA-Seq技術對不同品種不同日齡的鴨胸肌組織進行了差異表達基因的篩選，通過GO和KEGG分析發現TNNI1基因在品種間各個時間點都具有顯著差異，推測TNNI1基因可能在鴨早期骨骼肌生長發育中具有重要作用。

圖5 鴨基因啟動子區CpG島的總體甲基化水平(A)和單個位點的甲基化水平(B)Fig.5 Overall methylation level (A) and single locus methylation level (B) of CpG island in the promoter region of duck TNNI1 gene

表3鴨基因mRNA表達量與啟動子區CpG島單個位點的甲基化水平的相關性

Table3CorrelationanalysisbetweenTNNI1genemRNAexpressionandmethylationlevelofthesinglesiteofCpGislandinthepromoterregion

CpG位點相關系數胸肌腿肌P值胸肌腿肌1-0.066-0.1060.9340.89420.207-0.1050.7930.8953-0.042-0.1480.9580.8524-0.9970.2780.003**0.7225-0.1940.4700.8060.53060.2070.4770.7930.52370.4440.0630.7560.9378-0.5820.2780.4180.7229-0.395-0.0550.6050.94510-0.8640.7050.1360.295110.7590.4190.4520.724120.0420.5150.9580.485130.944-0.6930.0770.307140.156-0.7000.8440.300

為進一步深入研究其表達調控機制，本研究成功克隆了鴨TNNI1基因上游5′側翼區序列2 078 bp。已有的研究結果表明[9]，在人TNNI1基因啟動子的上游并未發現TATA-box和CAAT-box；在豬上[10]，研究發現TNNI1基因啟動子上游同時存在TATA-box和CAAT-box調控元件，另外還預測到了E-box、SP1、Oct-1、NF-KB、GATA1/2/3、AP1等轉錄因子結合位點。本研究采用生物信息學技術，分析鴨TNNI1基因啟動子上游序列發現，與豬上的研究結果一致，該序列存在多個C/EBP結合位點，另外還發現了SP1、RXR-beta、MRF4、GATA1、NF-KB、c-Myc等多個轉錄因子的結合位點。在人和豬的啟動子區均未發現CpG島(轉錄起始位點前3 000 bp)的存在。在鴨TNNI1基因啟動子區-2 032～-1 833和-206～-87處各發現了1個200 bp和120 bp的CpG島，推測鴨TNNI1基因的轉錄調控方式可能與哺乳動物存在差異。

通過軟件預測分析，TNNI1基因啟動子區包含了4個核心區，其中-1 916～-1 808區域內含3個候選核心啟動子區。預測的核心啟動子區正好位于CpG島(-2 032～-1 833)內。CpG島是易于發生甲基化的區域，啟動子區DNA甲基化能夠影響轉錄因子與DNA的結合，改變染色質的結構，調控基因表達。分析發現CpG島所在的區域有1個C/EBP和3個SP1結合位點，另外還包含了RXR-beta、HNF-3、NF-KB、c-Myc等轉錄因子的結合位點。C/EBPalp與基因轉錄效率關系密切[11]。SP1能和GC盒相結合，也能與轉錄因子如YY1、TBP結合，參與基因表達的轉錄調控[12]。目前還沒有TNNI1基因啟動子區DNA序列甲基化影響基因轉錄調控方面的報道。

與胸肌相比，腿肌因為承擔更多的運動功能，肌肉中慢肌纖維的比例高于胸肌。定量檢測的結果表明，TNNI1基因mRNA表達量在胸肌和腿肌中呈顯著差異，與哺乳動物中TNNI1基因在慢肌纖維中特異性表達[6]是一致的。采用亞硫酸氫鹽測序法檢測CpG島中各CpG位點的甲基化程度，發現胸肌和腿肌的CpG島的總體甲基化水平無顯著差異。推測，預測的核心啟動子區CpG島的甲基化修飾可能不是影響鴨TNNI1 基因在不同類型肌肉組織差異表達的主要調控因素，可能存在其他的如組蛋白修飾、miRNA干擾等的調控方式。CpG島中各個位點的甲基化水平與mRNA表達量進行相關性分析，胸肌CpG4位點的甲基化程度與mRNA表達量呈顯著負相關，這與通常認為的，甲基化程度越高，基因表達會被抑制的觀點是一致的。CpG4位點正好位于轉錄因子c-Myc的結合區域內。c-Myc能夠抑制肌肉細胞的終端分化，而YY1的持續表達能夠促進c-Myc的表達[13]；NF-KB能夠通過調節YY1和肌纖維相關基因的轉錄沉默調節骨骼肌成肌細胞的分化。對啟動子區序列進行分析，發現啟動子區存在3個NF-KB和2個YY1的結合位點。CpG4位點可能通過甲基化修飾，影響相關轉錄因子的結合，參與鴨TNNI1基因的轉錄調控過程。

本研究克隆獲得鴨TNNI1基因5′側翼區序列2 078 bp，預測分析發現其含有2個CpG島，其中1個CpG島(-2 078～-1 695)位于核心啟動子區，存在多個調控元件和轉錄因子結合位點，其總體甲基化水平與TNNI1基因表達水平無顯著相關，其中CpG4位點可能通過甲基化修飾，影響鴨TNNI1基因在胸肌中的轉錄調控。