綠原酸對雞肉腐敗菌的抑菌機理

蘇萌萌，孫芝蘭，劉 芳，吳海虹，張新笑，諸永志，王道營，徐為民,3,羅 章

(1.西藏農牧學院食品科學學院，西藏 林芝 860000；2.江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014；3.江蘇省肉類生產與加工質量安全控制協同創新中心，江蘇 南京 210095)

由微生物引起的食品腐敗變質一直嚴重威脅著食品安全[1]。雞肉作為優質的蛋白質來源[2]，由于其具有適宜微生物生長的pH、水分活度、營養成分等條件，所以在生產運輸和銷售等過程中很容易受到腐敗菌的污染。雞肉中的腐敗菌種類眾多，主要包括沙門氏菌、假單胞菌、腐生葡萄球菌、變形桿菌等[3-5]，嚴重影響著雞肉的品質，所以控制微生物污染是保證肉品品質的重點[6]。

綠原酸作為植物體有氧呼吸的天然產物[7]，具有生物活性[8-9]。在不對食物造成任何有害作用的情況下，對多種腐敗菌均有一定的抑菌效果[10-12]，這使得綠原酸作為生物防腐劑越來越受人們關注，然而綠原酸的抑菌機理尚不完全明了，亦無較系統的關于綠原酸抑菌機理的報道。據此，本研究就從杜仲中提取出來的綠原酸對雞肉中主要的腐敗菌(熒光假單胞菌和腐生葡萄球菌)的抑菌機理進行深入探討，為綠原酸的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)分離自市場上的冰鮮雞肉。

培養基：營養肉湯培養基(NB) 由北京奧博星生物技術有限公司生產,營養瓊脂培養基(NA) 由北京陸橋技術有限責任公司生產。

試劑：綠原酸由陜西慧科植物開發有限公司生產,ATP分析試劑盒、Bradford蛋白濃度測定試劑盒、cFDA染料、PI染料由碧云天公司生產,diSC3(5)、valinomycin、nigericin 由Sigma公司生產,戊二醛由成都市科龍化工試劑廠生產。

1.2 儀器與設備

Ultra View VOX激光共聚焦顯微鏡購自珀金埃爾默公司，掃描電鏡 EVOMA10/LS10 購自德國Zeiss Oberkochen公司，水浴鍋購自國華電器有限公司，臺式高速冷凍離心機購自德國Herolab公司，Anke TGL-16B離心機購自上海安亭科學儀器廠，LDZX-50KBS型滅菌鍋購自上海申安醫療器械廠，JY5002型電子天平購自上海良平儀器儀表有限公司，SPX-250B-Z型生化培養箱購自上海博訊實業有限公司醫療設備廠，SW-CJ-1FD型無菌操作臺購自蘇州凈化設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化與培養 將指示菌接種于NB培養基中，37 ℃ 200 r/min搖床培養至對數期后重新轉接到新的NB培養基中，重復此操作2到3次后，將菌種與滅過菌的體積濃度30%甘油以 1∶1的比例均勻混合，保存于-40 ℃的冰箱中。使用前，將凍存菌種解凍后，體積濃度2%接種于NB培養基中，37 ℃ 200 r/min搖床培養12 h備用。

1.3.2 最小抑菌質量濃度(MIC)和最小殺菌質量濃度(MBC)的測定 配制菌懸液：將體積濃度2%指示菌接種于NB培養基中，培養到對數期后收集菌株，重懸到生理鹽水中,按10倍稀釋后將菌懸液稀釋到106CFU/ml。吸收0.5 ml加入到4.5 ml NB培養基中，用槍頭吹勻待用。

MIC、MBC的測定：從配好的含10 mg/ml綠原酸的NB培養液中吸200 μl至96孔板中，采用二倍稀釋法將綠原酸稀釋到系列質量濃度 (0.1562 5～10.000 0 mg/ml)。在96孔板上每孔加100 μl不同質量濃度的綠原酸溶液和100 μl配制好的菌懸液，最終菌液為 5×105CFU/ml[13]。以NB培養液加菌懸液作為對照，每個試驗重復3次，37 ℃培養24 h后測OD600，以抑制菌株生長的最低綠原酸質量濃度為MIC。在MIC的基礎上，處理2 h時，從每孔中取10 μl混合菌液加到NA培養基上，37 ℃培養24 h后觀察菌落生長情況。以殺滅99.9%細菌(未見菌落生長)的最低綠原酸質量濃度為MBC[14]。

1.3.3 掃描電鏡 將已活化的指示菌按體積濃度2%接種于NB培養基中培養到對數期后，將1×MIC質量濃度的綠原酸加入菌液中作為處理組，同體積PBS緩沖液加菌液為對照組。37 ℃ 200 r/min搖床培養3 h后6 000 r/min離心10 min，用PBS緩沖液洗滌2次。將菌液固定于體積濃度2.5%的戊二醛緩沖液中，4 ℃ 24 h，2 500 r/min 4 ℃離心10 min，去上清液，加蒸餾水放置10 min再次離心，重復操作3次，以50%、70%、80%、90%的乙醇按順序依次洗滌，每次洗滌后放置10 min，離心，加入100%的乙醇后放置30 min，將菌泥固定于鏡片上，在通風櫥中風干，噴金后在掃描電鏡下觀察、拍照[15-16]。

1.3.4 胞外ATP的檢測 將已活化的指示菌按體積濃度2%接種于NB培養基中培養到對數期后，離心、用PBS緩沖液洗滌3次后，重懸到PBS緩沖液中。加入1×MIC質量濃度的綠原酸培養0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h后離心，取上清液待用。以未加入綠原酸處理的懸浮液作為對照。采用熒光標記法，具體操作步驟參照碧云天ATP試劑盒說明書。試驗重復操作3次。

1.3.5 胞外蛋白質的檢測 將已活化的指示菌按體積濃度2%接種于NB培養基中培養到對數期后，離心、重懸到PBS緩沖液中。加入1×MIC質量濃度的綠原酸培養0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h后離心，取上清液待用。采用Bradford法，利用考馬斯亮藍G-250與蛋白質結合的特點使溶液被染為藍色[17]，測定595 nm處的吸光值，根據蛋白質標準曲線和樣品的體積計算蛋白質濃度。以指示菌加PBS緩沖液作為對照組，試驗重復3次。具體操作步驟參照碧云天Bradford蛋白質質量濃度測定試劑盒說明書。

1.3.6 膜電位的檢測 采用熒光探針diSC3(5)測定指示菌細胞膜電位[18]。將已活化的指示菌按體積濃度2%接種培養到對數期后，離心、重懸到PBS緩沖液中。將0.5 mmoL/L的diSC3(5)加入到菌懸液中，放置15 min，向菌懸液中加入100 mmoL/L KCl用以平衡胞內外K+濃度。用移液槍各吸取1 ml上述菌懸液，加入1 μmoL/L valinomycin、nigericin和1×MIC質量濃度的綠原酸，取1 ml菌懸液作為空白對照。酶標儀測其熒光強度(ex=622 nm，em=670 nm)，每2 min測定1次，測定10 min。試驗重復操作3次。

1.3.7 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測 將已活化的指示菌按體積濃度2%接種于NB培養基中培養到對數期后加入 1×MIC質量濃度的綠原酸，37 ℃ 200 r/min搖床培養1 h，以同體積PBS緩沖液加菌液為對照組。8 000 r/min離心3 min，去上清液后加入PBS緩沖液洗滌1次，離心。將菌體重懸在1 ml PBS緩沖液中，加入50 μl熒光探針cFDA，37 ℃孵育15 min，加入15 μl熒光染液PI，37 ℃ 孵育15 min，8 000 r/min離心3 min后將菌泥重懸在1 ml PBS緩沖液，重復操作3次，用移液槍吸取2 μl混合菌液于載玻片上，蓋上蓋玻片后在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察、拍照。

2 結果與分析

2.1 最小抑菌質量濃度和最小殺菌質量濃度

試驗結果如表1，綠原酸對于熒光假單胞菌、腐生葡萄球菌具有抑菌、殺菌作用。MIC和MBC均為5 mg/ml。

表1綠原酸對熒光假單胞菌、腐生葡萄球菌的MIC、MBC

Table1Theminimalinhibitoryconcentration(MIC)andminimalbactericidalconcentration(MBC)ofPseudomonasfluorescensandStaphylococcussaprophyticustreatedbychlorogenicacid

菌種MIC(mg/ml)MBC(mg/ml)熒光假單胞菌5.05.0腐生葡萄球菌5.05.0

2.2 綠原酸對菌種形態的影響

利用掃描電鏡對微生物進行觀察可以更直觀地掌握微生物的形態[16]。如圖1所示，未加入綠原酸的對照組中，熒光假單胞菌在電鏡下呈飽滿、圓潤桿狀，菌體完整，表面細滑有光澤，充滿活力。經過綠原酸處理3 h后，熒光假單胞菌表面粗糙，大多數菌體扁平，色澤也變得暗淡，菌體變形嚴重，出現明顯孔洞；未加入綠原酸的對照組中，腐生葡萄球菌在電鏡下呈飽滿的球狀，菌體完整，色澤明亮，體態圓潤。經過綠原酸處理3 h后，部分菌體色澤變暗，菌體表面有絮絨狀結構出現，大多數菌體有凹陷和孔洞出現。說明綠原酸能夠破壞熒光假單胞菌和腐生葡萄球菌的表面結構，使細胞受損嚴重。并且綠原酸對熒光假單胞菌的作用效果更強。

A：熒光假單胞菌；B：腐生葡萄球菌。圖1 綠原酸處理后的熒光假單胞菌、腐生葡萄球菌掃描電鏡結果Fig.1 SEM images of P. fluorescens and S. saprophyticus treated by chlorogenic acid

2.3 綠原酸對菌種細胞膜的影響

2.3.1 綠原酸處理對ATP流失的影響 胞外ATP來源于細胞的釋放，其含量的測定直接可以說明細胞膜的受損情況[19]。ATP含量如圖2所示，在未加入綠原酸的對照組中，熒光假單胞菌和腐生葡萄球菌的胞外ATP含量隨著時間的增加均保持在50 nmol/ml以內，而在加入5 mg/ml綠原酸的處理組中，熒光假單胞菌的胞外ATP含量在處理1 h后明顯呈上升趨勢，在2.5 h內增加到263 nmol/ml；腐生葡萄球菌的胞外ATP含量在處理1 h后呈明顯上升趨勢，在2.5 h內增加到230 nmol/ml。結果說明綠原酸導致了熒光假單胞菌和腐生葡萄球菌細胞膜的受損，從而使胞內ATP流失。隨著綠原酸處理的時間越長，細胞膜的受損情況越嚴重；相對于熒光假單胞菌，腐生葡萄球菌的耐抗性可能更強。

圖2 綠原酸處理后熒光假單胞菌、腐生葡萄球菌的胞外ATP濃度Fig.2 Extracellular ATP concentration of P. fluorescens and S. saprophyticus treated by chlorogenic acid

2.3.2 綠原酸對胞外蛋白的影響 如圖3所示，在未加入綠原酸的對照組中，2.5 h熒光假單胞菌和腐生葡萄球菌的胞外蛋白質量濃度分別為12.35 μg/ml和13.87 μg/ml。而在加入5 mg/ml綠原酸的處理組中，2.5 h熒光假單胞菌和腐生葡萄球菌的胞外蛋白質量濃度上升為321.25 μg/ml和330.79 μg/ml。由此可見，加入5 mg/ml綠原酸的處理組胞外蛋白質量濃度遠遠高于未加入綠原酸處理的對照組，說明綠原酸對熒光假單胞菌和腐生葡萄球菌的細胞膜有明顯影響，通過改變細胞膜通透性導致細胞內蛋白質滲透到胞外，綠原酸處理的時間越長蛋白質滲透越明顯。

圖3 綠原酸處理后熒光假單胞菌、腐生葡萄球菌的胞外蛋白質量濃度Fig.3 Extracellular protein concentration of P. fluorescens and S. saprophyticus treated by chlorogenic acid

2.3.3 綠原酸對膜電位(△φ)的影響 利用熒光探針diSC3(5)測定指示菌的膜電位，當指示菌細胞膜破損時，diSC3(5)會滲透到胞外使測定的熒光量增強，膜電位發生變化。利用尼日利亞菌素(nigericin)能夠保持細胞最大電位，纈氨霉素(valinomycin)能夠完全破壞細胞電位的原理，將二者設置為陰性和陽性對照[20]。如圖4、圖5所示，A為熒光假單胞菌未加入綠原酸的對照組在測定的10 min內熒光值增加到2 784，而加入綠原酸的處理組在測定的10 min內熒光值增加到12 335；B為腐生葡萄球菌未加入綠原酸的對照組在測定的10 min內熒光值增加到2 720，而加入綠原酸的處理組在測定的10 min內熒光值增加到14 208。2種指示菌在加入綠原酸處理2 min后，熒光值迅速增加，這說明綠原酸造成熒光假單胞菌和腐生葡萄球菌細胞膜損傷，膜電位被嚴重破壞。

圖4 綠原酸處理后熒光假單胞菌的膜電位Fig.4 The membrane potential of P. fluorescens treated by chlorogenic acid

圖5 綠原酸處理后腐生葡萄球菌的膜電位Fig.5 The membrane potential of S. saprophyticus treated by chlorogenic acid

2.3.4 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察 通過cFDA染料、PI染料對細胞熒光染色，二者滲入細胞的能力不同，在激光掃描共聚焦顯微鏡下,cFDA能夠較容易穿過細胞膜，將健康細胞染色呈現綠色熒光；PI不能穿過完整的細胞膜，但能使致死細胞染色呈現紅色熒光，而亞致死細胞在顯微鏡下將紅色、綠色熒光疊加呈現黃色熒光[21]。如圖6所示，A為熒光假單胞菌，B為腐生葡萄球菌。未加入綠原酸的對照組在顯微鏡下可以明顯看到絕大多數的菌體呈綠色熒光，幾乎沒有菌體表面呈紅色，這說明未加入綠原酸的對照組菌體健康，生長狀況良好；加入綠原酸的處理組在顯微鏡下，可以看到熒光假單胞菌大多數菌體都被染成紅色熒光，部分菌體呈現綠色和黃色熒光，腐生葡萄球菌也呈現出大量紅色熒光。這說明經綠原酸處理后的2種指示菌細胞膜均有不同程度的受損，而綠原酸對熒光假單胞菌細胞膜的作用比腐生葡萄球菌更強一些。

A：熒光假單胞菌；B：腐生葡萄球菌。圖6 綠原酸處理后熒光假單胞菌、腐生葡萄球菌在共聚焦顯微鏡下的狀態Fig.6 CLSM images of P. fluorescens and S. saprophyticus treated by chlorogenic acid

3 結 論

本研究通過測定綠原酸對熒光假單胞菌和腐生葡萄球菌的最小抑菌質量濃度、最小殺菌質量濃度，利用掃描電鏡觀察細胞形態，對胞外ATP、蛋白質質量濃度的測定觀察胞內大分子物質的泄漏情況，以及根據激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察的結果和膜電位的測定進一步驗證膜損傷情況，深入探究綠原酸對雞肉腐敗菌(熒光假單胞菌和腐生葡萄球菌)的抑菌機理。得到以下結論：1)綠原酸對熒光假單胞菌和腐生葡萄球菌這2種指示菌具有抑菌、殺菌效果。2)綠原酸對2種指示菌的最小抑菌質量濃度、最小殺菌質量濃度為5 mg/ml。3)綠原酸是通過作用于2種指示菌的細胞膜，使細胞膜發生損傷從而導致胞內蛋白質、ATP等大分子物質泄漏，膜電位被破壞，最終達到抑菌、殺菌效果。