豬偽狂犬病毒野毒株與疫苗株的多重PCR鑒別

姜子義，李 碧，蔡 瑤，顏久淇，龔雙燕，樊 毅，黃劍波，朱 玲,2，徐志文,2

(1.四川農業大學動物醫學院，四川 成都 611130；2.四川農業大學動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 成都 611130)

豬偽狂犬病毒( Pseudorabiesvirus, PRV )屬于皰疹病毒科α-皰疹病毒亞科，可感染多種動物，其中豬是最敏感、唯一的自然宿主，常呈流行性感染[1-3]。2012年以來，豬偽狂犬病毒變異株在華東、華中、東北、西南和華北地區呈爆發態勢[4]，給養豬業造成了極大的經濟損失。PRV gE抗體陽性率從2012年的11.5%上升到了2014年的64.3%[5]，2015-2017年依然保持非常高的陽性率，通過分離毒株測序對比發現爆發地區都是新變異的野毒株感染。

免疫豬群再次發病，陰性豬場重新轉陽性是近年來豬偽狂犬病大流行的最主要特征[6]，豬偽狂犬病防控面臨著巨大的挑戰。上世紀末中國開始使用gE缺失的Bartha-K61(gE-)疫苗[7]，近年中國自主研發的基因缺失株SA215(gE-gI-TK-)使用相當廣泛，對經典毒株有非常好的防控力[8]。很多研究者報道現有疫苗對近年來變異毒株侵染缺乏保護力，血清陰性重新轉陽性[8-9]，在綿羊攻毒保護模型中對新流行變異毒株侵染的保護不到50%[10]。在未有針對新變異毒株疫苗的情況下，快速區分野毒株和疫苗株成為目前防控豬偽狂犬病疫情的當務之急。

本研究旨在建立一種快速、穩定和有效的多重PCR檢測方法，快速鑒別發病豬感染的變異野毒株和之前接種的疫苗種類，從而采取不同的緊急措施防控豬偽狂犬病疫情。

1 材料與方法

1.1 疫苗和病毒

PRV基因缺失疫苗株(SA215、Bartha-K61)、PRV變異株(2014年分離的XJ株)、豬圓環Ⅱ型病毒(PCV-2)、細小病毒(PPV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、T3256質粒(TK基因缺失陽性對照質粒)、PP63質粒(gE基因缺失陽性對照質粒)均由四川農業大學動物生物技術中心保存提供。

1.2 細胞與試劑

Vero細胞購自武漢典型物保藏中心。HSTaqDNA聚合酶、dNTPs、2×GC Buffer Ⅱ、DL1000TMMaker均購置于大連寶成生物工程有限公司。

1.3 gE、gB和TK基因核苷酸序列分析

參照文獻[11]和[12]中的引物進行gE、gB及TK全基因擴增和測序。利用NCBI進行BLAST對比分析，發現PRV-XJ、PRV-JJ、PRV-MS和PRV-YA新分離株gE基因擴增核苷酸序列與國內野毒株核苷酸序列的同源性在91.6%至98.8%之間，氨基酸序列同源性在92.1%至98.6%之間，與國內2012年后分離毒株之間核苷酸序列同源性都超過了97.8%，與經典毒株Fa、Ea、MinA株核苷酸序列同源性在87.9%至96.8%之間。新分離株gB基因擴增核苷酸序列與國內野毒株核苷酸序列的同源性在97.4%至100.0%之間，氨基酸序列同源性在96.6%至100.0%之間，與國內2012年后分離毒株之間核苷酸序列同源性都超過了98.8%，與經典毒株Fa、Ea、MinA株核苷酸序列同源性也達到98.2%以上。新分離株TK基因擴增核苷酸序列與國內野毒株核苷酸序列同源性在98.2%至100.0%之間，氨基酸序列同源性在97.6%至100%之間，與國內2012年后分離毒株之間核苷酸序列同源性高達99%，與經典毒株Fa、Ea、MinA株核苷酸序列同源性也超過了98.4%。

PRV-XJ、PRV-JJ、PRV-MS和PRV-YA新分離株的gE、gB和TK基因都高度保守。大量核苷酸序列對比結果顯示，2012以來新流行的PRV變異株之間具有共同的分子特征，即gE基因編碼的氨基酸序列第48位和第492位各插入了1個天冬氨酸，此變異處可作為判斷PRV是否為變異毒株的重要指標之一[13-14]。

1.4 引物設計

參照GenBank中已發布的序列及SA215、Bartha-K61疫苗株的PRVgE基因、gB基因以及TK基因的序列，分析對比，找出高度保守區段，應用Primier5和Oligo7.0軟件,優化設計引物gE-F/gE-R、gB-F/gB-R、TK-F/TK-R(表1)，交上海生工生物工程有限公司合成。

表1引物序列

Table1Sequenceofprimers

基因引物名稱 堿基序列 (5'→3') 產物長度 (bp)gEgE-FCATGGTGCTGGGGC-CCACGATCGTC0(Bartha-K61株)、0(SA215株)、531(野毒株)gE-RCGTTGAGGTCGCCGTCGAGGT-CATgBgB-FCCGTCCTCCTTGAGCGYCTTC264(Bartha-K61株)、264(SA215株)、264(野毒株)gB-RCGGCATCGCCAACTTCTTCCTKTK-FCGCACACGCACTGCCGGAT710(Bartha-K61株)、432(SA215株)、710(野毒株)TK-RGCCTTCGCGACGCCGTACCTG

1.5 鑒別gE、gB、TK基因的多重PCR方法的建立

1.5.1 多重PCR反應的退火溫度(Tm)優化 在單一基因PCR的基礎上，確定30 μl三重PCR優化體系進行試驗，在退火溫度 60～75 ℃進行梯度試驗找出最適退火溫度。

1.5.2 多重PCR反應中多個引物濃度優化 二重PCR反應中，固定一對引物濃度改變另一對引物加入量確定其使用量，然后以優化的一對引物加入量不變，改變另一對引物加入量，一同確定2對引物的最適條件。三重PCR反應過程建立在二重PCR的基礎上，保持二重PCR引物用量不變確定第三對引物量，最終確定三重PCR最適引物濃度。

1.6 敏感性試驗

采用優化后的PCR條件，PRV基因缺失疫苗株(SA215、Bartha-K61)、PRV變異株(2014年分離的XJ株)分別選擇不同模板的量，1 μl 1.8×1011拷貝、1.8×1010拷貝、1.8×109拷貝、1.8×108拷貝、1.8×107拷貝、1.8×106拷貝、1.8×105拷貝進行PCR擴增。

1.7 特異性試驗

采用優化后的反應條件和體系分別擴增PRV基因缺失疫苗株(SA215、Bartha-K61)、PRV變異株(2014年分離的XJ株)、豬圓環Ⅱ型病毒(PCV-2)、細小病毒(PPV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)和豬瘟病毒(CSFV)。同時用建立的多重PCR檢測方法對其他變異株PRV-JJ、PRV-MS、PRV-YA和經典毒株PRV-Fa進行檢測。擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,然后用溴化乙錠(EB)染色后在凝膠成像系統下成像、觀察。

1.8 重復性試驗

采用優化后的反應條件和體系，將PRV基因缺失疫苗株(SA215、Bartha-K61)和PRV變異株(2014年分離的XJ株)連續擴增3次。擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,然后用溴化乙錠(EB)染色后在凝膠成像系統下成像、觀察。

1.9 臨床樣品檢測試驗

采用優化后的反應條件和體系，對收集的76份豬偽狂犬病臨床樣品進行檢測。

2 結 果

2.1 多重PCR反應條件優化

通過對多重PCR各種反應條件的試驗探索，確定gE、gB、TK基因多重PCR反應體系為：2×GC Buffer Ⅱ 15.00 μl、2.5 mmol/L dNTPs 0.75 μl、20 μmol/LgB上下游引物各0.60 μl、20 μmol/LTK上下游引物各0.75 μl、20 μmol/LgE上下游引物各0.75 μl，模板3.10 μl、HSTaq酶0.75 μl，去離子水補足到30.00 μl。退火溫度(Tm)優化為66 ℃，反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 40 s，66 ℃ 45 s，72 ℃ 40 s，30個循環；最后72 ℃延伸7 min。

PRV野毒(2014年分離的XJ株)條帶為264 bp(gB基因)、531 bp(gE基因)、710 bp(TK基因)，PRV基因缺失疫苗株Bartha-K61條帶為264 bp(gB基因)、710 bp(TK基因)，PRV基因缺失疫苗株SA215條帶為264(gB基因)、432 bp(TK基因)(圖1)。

M：Marker DL1000；1：PRV基因缺失疫苗株SA215；2：PRV基因缺失疫苗株Bartha-K61；3：PRV變異株(2014年分離的XJ株)。圖1 偽狂犬病毒野毒株和疫苗株的多重PCR鑒別Fig.1 Multiplex PCR identification of pseudorabies virus(PRV) vaccine strains and wild viruses

2.2 豬偽狂犬病毒多重PCR檢測方法的敏感性

采用優化后的PCR反應條件和體系，用不同濃度模板量1 μl 1.8×1011拷貝、1.8×1010拷貝、1.8×109拷貝、1.8×108拷貝、1.8×107拷貝、1.8×106拷貝、1.8×105拷貝進行PCR擴增反應。結果表明模板量小于1 μl 1.8×106拷貝時沒有發現目標條帶。

2.3 豬偽狂犬病毒多重PCR檢測方法的特異性

用建立的豬偽狂犬病毒多重PCR檢測方法檢測豬常見疫病病原豬圓環Ⅱ型病毒(PCV-2)、細小病毒(PPV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)和豬瘟病毒(CSFV)，以及豬偽狂犬病毒其他變異株PRV-JJ、PRV-MS、PRV-YA和經典毒株PRV-Fa。結果(圖2)顯示，豬圓環Ⅱ型病毒(PCV-2)、細小病毒(PPV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)和豬瘟病毒(CSFV)均未出現特異性條帶，PRV基因缺失疫苗株(SA215、Bartha-K61)和PRV變異株PRV-XJ、PRV-JJ、PRV-MS、PRV-YA和經典毒株PRV-Fa均有特異性目的條帶。

M：Marker DL1000；1：豬圓環Ⅱ型病毒(PCV-2)；2：細小病毒(PPV)；3：豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)；4：豬瘟病毒(CSFV)；5：PRV基因缺失疫苗株SA215；6：PRV基因缺失疫苗株Bartha-K61；7：PRV變異株(2014年分離的XJ株)；8：PRV經典株(Fa株)；9：PRV變異株(YA株)；10：PRV變異株(MS株)；11：PRV變異株(JJ株)；12：PRV變異株(2014年分離的XJ株)；13：PRV基因缺失疫苗株Bartha-K61；14：PRV基因缺失疫苗株SA215。圖2 豬偽狂犬病毒多重PCR檢測方法的特異性Fig.2 Specificity of the method for identification of swine pseudorabies virus by multiplex PCR

2.4 豬偽狂犬病毒多重PCR檢測方法的重復性

將PRV基因缺失疫苗株(SA215、Bartha-K61)和PRV變異株(2014年分離的XJ株)連續檢測3次，結果完全一致，說明本方法具有良好的重復性和穩定性。

2.5 臨床樣品檢測試驗結果

用建立的豬偽狂犬病毒多重PCR檢測方法，對收集的76份豬偽狂犬病臨床樣品進行檢測。結果顯示PRV野毒株、PRV基因缺失疫苗株(SA215、Bartha-K61)均可檢出，其中39份為PRV野毒株，16份為PRV基因缺失疫苗株SA215，21份為PRV基因缺失疫苗株Bartha-K61。檢測結果與樣品來源注射疫苗記錄、單一PCR檢測及測序結果一致。

3 討 論

2012年以來，全國超過20個省份先后報道發現PRV變異株[15]。疫情表現為大流行，不同地區PRV變異毒株的毒力水平和感染強度都有較大差異，變異株之間的親緣關系較近，變異株與國內傳統毒株(Fa、Ea及Min-A等)親緣關系較遠[8,15-18]。但變異毒株的起源與傳統毒株相同，其中華東地區的感染率最高，分離的變異株毒力最強[19]。對新發現PRV變異毒株的研究結果表明，當前各地區流行的不同變異毒株在毒力增強的同時抗原也發生了一定程度的變異[17-18]。這也解釋了當前廣泛使用的基因缺失疫苗株SA215、Bartha-K61無法對變異豬偽狂犬病毒侵染提供完全免疫保護的原因[20-24]。

本試驗所建立的區分豬偽狂犬病毒野毒株與疫苗株的多重PCR檢測方法能夠可靠、快速、有效地鑒別野毒株和疫苗株，區分度大。研究中針對PRV的3個重要高度保守基因gE、gB和TK基因設計了3對特異性引物，通過PCR擴增條件的優化，確定3對引物的最佳退火溫度為66 ℃。在單引物敏感性試驗的基礎上，通過優化引物濃度，最后建立了多重PCR檢測方法。試驗結果表明，gE、gB、和TK基因的高度保守確保了擴增片段的正確性，避免了假陽性結果的發生，3個基因的目的條帶264 bp(gB)、432 bp(TK)、531 bp(gE)和710 bp(TK)區分度較高，通過電泳能夠直觀區分野毒株和疫苗株。敏感性試驗結果顯示，本研究的多重PCR檢測方法能夠檢測的最低濃度為1 μl 1.8×106拷貝，具有較高的靈敏度。用多重PCR方法對收集的76份臨床樣品進行檢測，檢測結果完全正確，與普通檢測方法一致，證明本方法切實有效。本研究所建立的多重PCR檢測方法可用于目前PRV疫情檢測，為控制豬偽狂犬病毒大流行、大爆發提供了一種可靠、快速、有效的檢測方法，對切實防控豬偽狂犬病具有十分重要的意義。