表油菜素內酯在緩解水稻砷毒害中的作用

練旺民，徐 薇，孟卓玲，陶之歡，金 珂，鄭 晶，張佳藝，劉慶坡

(浙江農林大學農業與食品科學學院，浙江 臨安 311300)

砷是重要的環境污染物，為表土污染五大有害元素之一[1]，對動、植物具有強烈毒害作用。長期以來，由于自然地質條件以及含砷農用化學品的大量使用以及砷礦開采等人類作業活動，造成土壤中的砷過量積累。特別是近年來，隨著現代工農業的迅速發展，受砷污染的土壤面積逐年增加，污染程度呈進一步惡化趨勢，嚴重影響到“菜籃子”的質量安全。據統計，全球目前有超過 1.5×108人正遭受慢性砷毒害，其中約 1.0×108人口分布在南亞和東南亞地區[2]。其中，中國是受砷毒害最嚴重的國家之一。

相比于小麥、玉米等旱糧作物，水稻對砷的吸收與富集能力更強[3-4]。水稻是世界約 3.0×109人口的主糧。在中國，約60%的人口以稻米為主食。所以，食用稻米已成為人體砷暴露危害的一個重要途徑[5-6]。另外，砷易在植物的根系、地上部莖葉中積累，而很多作物的莖葉部分常被作為家畜的飼料使用，這很容易使砷通過食物鏈進行“生物放大”[7]，進一步危害人類健康。因此，水稻砷污染已成為關系人類健康的世界性環境、衛生與食品質量安全重大問題，亟待解決。

自然界中，砷主要以無機砷[砷酸鹽(AsV)和亞砷酸鹽(AsIII)]和有機砷(甲基化砷)等賦存形態存在，其中無機砷的毒性大于有機砷，而無機砷中AsIII的毒性高于AsV [2,5]。在淹水條件下，稻田土壤中砷的溶解度和生物有效性大幅增加，AsIII是主要的存在形態[2,5]。當土壤pH值為2～9 時，AsIII常以中性分子形式存在，其化學性質與硅酸鹽相似，因而可通過硅酸鹽轉運蛋白進入根系，進而向維管束遷移[8-10]。近年來，有關水稻對砷吸收、轉運、積累等代謝重要功能基因的鑒定及作用機理研究等取得重要進展[2,7,11-13]：AsIII可通過水通道蛋白超家族中NIP和PIP亞家族成員被根系吸收[14-15]；吸收的部分AsIII與谷胱甘肽(GSH)和/或植物鰲合肽(PC)形成AsIII-GSH和/或AsIII-PC復合物，被轉入液泡中隔離；另有部分AsIII通過Lsi1外排到土壤溶液或培養介質中[16]；剩余AsIII則通過硅轉運蛋白Lsi2卸載到木質部，進而向地上部莖葉和籽粒中轉運并積累[17]。

油菜素內酯(Brassinosteroid, BR)，又稱蕓薹素內酯，是植物中最早發現的一類甾醇類激素[18]，它廣泛存在于植物的花粉、種子、莖稈和葉片等組織器官中，參與調控植物多方面的生長發育過程[19]，尤其在促進種子萌發、幼苗生長，提高光合作用效率，延遲器官衰老和提高抗逆性等方面具有重要作用[20-21]。表油菜素內酯(Epibrassinosteroid, EBR)是一種人工合成的高活性油菜素內酯類似物，具有促進植物生長，促進細胞伸長和分裂，促進植物光合作用，提高植物抗逆性等多種生理功能[22-25]。尚宏芹等[26]研究發現，外源EBR可緩解汞脅迫對小麥幼苗的傷害，這可能與EBR能提高逆境條件下小麥中的抗氧化酶活性及抗氧化物質含量，降低丙二醛(Malondialdehyde, MDA)和 H2O2含量等有關。但是，外源EBR能否緩解亞砷酸鹽對水稻的毒害作用尚不清楚。

因為AsIII是厭氧條件下土壤溶液中砷的主要存在形式，而且AsIII對水稻的毒性高于AsV，所以本研究在采用營養液水培條件下，選擇亞砷酸鈉進行砷脅迫處理，分析表油菜素內酯對砷脅迫的緩解作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

選用砷耐受性中等的秈稻品種93-11為試驗材料。挑選飽滿種子若干，0.5%次氯酸鈉消毒15 min后用蒸餾水沖洗3～5次，然后在蒸餾水中浸泡過夜。將種子置于鋪有潤濕發芽紙的發芽盒中發芽，待幼苗長至5 cm左右時，選取長勢均勻一致的水稻幼苗轉移到培養器皿中。每個培養器皿中固定8株幼苗并在其中加入2 L Kimura營養液(配方見表1)，在培養箱繼續培養，培養條件為30 ℃光照16 h和25 ℃黑暗8 h。15 d后，選擇長勢均勻的水稻植株分成3組，分別進行以下處理：①普通營養液(CK)培養+蒸餾水噴施；②含30 μmol/L AsIII(NaAsO2)的營養液培養+蒸餾水噴施；③含30 μmol/L AsIII(NaAsO2)的營養液培養+ 0.1 μmol/L 2,4-表油菜素內酯(2,4-Epibrassinosteroid)噴施。每個處理設6個重復，每個重復8株。處理3 d，每天更換營養液。培養環境與處理前一致，于黑暗與光照交替時噴施EBR，每盆8株苗共噴80 ml，全株均勻噴施。

1.2 生理指標測定

1.2.1 株高和根長相對增量及生物量測定 分別在處理第0 d和第3 d測定水稻幼苗的株高、根長和鮮質量，計算相對生長量。同時用烘箱殺青后測定地上部生物量的干質量。

1.2.2 砷含量測定 將干燥后的根系和莖稈(不包含葉片)分別研磨成粉末。在各處理粉末樣品(0.3 g)中分別加入2 ml HNO3和0.5 ml H2O2，120 ℃條件下硝化反應24 h。反應結束后冷卻，將硝化溶液用去離子水補成20 ml。用電感耦合等離子體質譜儀(ICP-MS，Agilent 7500a)測定樣品中的總砷含量。

表1水稻水培營養液配方

Table1Nutrientcompositionforhydroponiccultureofriceplants

成分 名稱濃度大量元素硝酸鉀 (mmol/L)0.091磷酸二氫鉀 (mmol/L)0.100硫酸銨 (mmol/L)0.183硫酸鎂 (mmol/L)0.274硝酸鈣 (mmol/L)0.183微量元素氯化錳 (μmol/L)0.5硼酸 (μmol/L)3.0鉬酸銨 (μmol/L)0.1硫酸銅 (μmol/L)0.2硫酸鋅 (μmol/L)0.4乙二胺四乙酸鈉鐵 (μmol/L)40.0

營養液pH調至5.5。

1.2.3 砷吸收能力與轉移能力測定 采用植株地上部和根系中的總砷含量與根干質量的比值來表示水稻根部吸收砷的能力，即作為砷吸收能力的指標。SAU=[(C根-砷×M根)+(C地上部-砷×M地上部)]/M根，式中，SAU(Specific arsenic uptake)為水稻對砷的吸收能力，C根-砷和C地上部-砷分別為根系和地上部中總砷含量，M根和M地上部分別為根系和地上部的干質量。砷轉移速率(Translocation factor，TF)為評價砷從地下部根系轉移到地上部能力的指標，用地上部中總砷含量與根系中總砷含量的比值來表示。

1.2.4 伊文思藍染色 挑選長勢一致的幼苗，將其最長的2～3條根剪下，在0.5 mmol/L CaCl2溶液(pH=4.5)中浸泡5 min,用純水洗滌，吸干水分后，用伊文思藍溶液(0.025%)浸泡0.5～1.0 h,用水清洗15 min，吸干。取1.5 cm左右根尖在體視顯微鏡(型號為SZX10，OLYMPUS公司產品)下觀察染色情況。

1.2.5 二氨基聯苯胺(3,3-diaminobenzidine，DAB)和氮藍四唑(Nitrobluetetrazolium，NBT)染色 選取水稻幼苗同一部位的葉片(約1.5 cm長),分別浸沒在1 mg/mL 的DAB和NBT溶液中。避光條件下用DAB染液靜置染色24 h，再在強光下用NBT染液染色，直至出現明顯表型,然后將樣品浸沒在無水乙醇中，于70 ℃水浴中脫色至黃白色。脫色完成后，將樣品冷卻并浸入70 %乙醇中。使用體視顯微鏡觀察染色情況。

1.2.6 相對電導率測定 使用數字電導率儀檢測根系的電解質滲漏。用蒸餾水沖洗幼苗根系，取鮮樣0.1 g，置于裝有10 ml去離子水的試管中室溫下浸泡處理12 h,測定浸出液電導率(R1)，然后沸水浴加熱30 min，冷卻至室溫后測定電導率(R2)，同時設置一組純水對照，煮沸前測定電導率(R3)，煮沸后測定電導率(R4),計算相對電導率。相對電導率=(R1-R3)/(R2-R4)×100%。

1.2.7 脯氨酸含量測定 將新鮮根系剪碎，加入5 ml 3%磺基水楊酸溶液，沸水浴中浸提10 min，冷卻至室溫，吸取2 ml上清液，加入2 ml冰醋酸、4 ml 2.5%酸性茚三酮溶液，再次置于沸水浴中顯色60 min，冷卻后加入4 ml甲苯，渦旋振蕩，萃取紅色物質，靜止后取甲苯層用分光光度計測定520 nm處的吸光值。

1.2.8 非蛋白質巰基化合物(Non-protein thiols，NPT)含量測定 取鮮樣的全部葉片和根系，液氮研磨，加入4 ml預冷的5%磺基水楊酸溶液，在12 000g、4 ℃條件下離心15 min，取上清液1 ml，依次加入1.85 ml 0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH=8.2)和0.15 ml 10 mmol/L DTNB [5,5′-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)]，靜置20 min后用分光光度計測定412 nm處的吸光值。

1.2.9 砷吸收、轉運和積累等相關基因的表達分析 在亞砷酸鹽處理后1 h、3 h、6 h、12 h和24 h等不同時間點分別取水稻根系，采用孫德權等[27]方法提取總RNA。根據設計的基因特異引物(表2)，利用定量RT-PCR對6個功能已知的水稻砷吸收、轉運和積累等相關基因的表達進行分析。采用2-△△Ct法計算基因的相對表達量。

1.3 統計分析

所有數據均來自多次(≥3次)重復試驗。采用Rv3.4.0軟件繪圖, 并對不同處理數據進行單因素方差分析(ANOVA)，在0.05水平上分析其差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 表油菜素內酯對砷處理下水稻株高、根長和生物量的影響

從圖1可以看出，AsIII脅迫處理可顯著抑制水稻幼苗的生長。與CK相比，AsIII處理后水稻株高和根長分別下降了95.2%和94.9%。但是，與單獨AsIII處理相比，外施表油菜素內酯后幼苗的株高和根長得到明顯恢復，分別提高了865%和759%。此外，AsIII脅迫對水稻幼苗地上部生物量也有顯著抑制作用(圖2和圖3)。與CK相比，AsIII處理后單株鮮質量和干質量分別下降了70.2%和25.9%；而與單獨AsIII處理相比，外施油菜素內酯后單株鮮質量和干質量分別提高了161.0%和13.6%，差異達到顯著水平。

表2定量RT-PCR擴增所使用的引物序列

Table2PrimersequencesusedforquantitativeRT-PCRamplification

基因名稱 正向引物(5'→3') 反向引物(5'→3') 作用[7,12] 登錄號ActinATCATGAAGTGCGACGTGGAATGCCAGGGAACATAGTGGT內參基因XM_015774830OsLsi1ATCTACTTCCTGGGCCCAGTAGGAGAGCTTCTGGGAGGAG亞砷酸鹽吸收XM_015770687OsLsi2ATCACCTTCCCCAAGTTCCCAGCTCCCTCCAGTACATGC亞砷酸鹽向木質部卸載XM_015776731OsPIP2;4TGGGCTCTTTCTCCTTCAGGCAGGGCTTCTCACTTAAAC亞砷酸鹽吸收XM_015789100OsNIP2;2GGACCAACTCTCGGGTGAACCACGTCACGAACACAAGCAG亞砷酸鹽吸收XM_015788648OsPT8AGAAGGCAAAAGAAATGTGTGTTA-AATAAAATGTATTCGTGCCAAATT-GCT砷酸鹽吸收XM_015758636OsHAC4TGGCTTCACTCTTCGGCAACATTCTTGAATCCCGCGTCCA砷酸還原酶XM_026023318

不同小寫字母表示不同處理間差異達到顯著水平(P<0.05)。圖1 表油菜素內酯對砷抑制水稻幼苗株高和根長相對增長量的緩解作用Fig.1 Effects of epibrassinolide on alleviation of inhibition of relative growth of plant height and root elongation of rice seedlings under arsenic stress

不同小寫字母表示不同處理間差異達到顯著水平(P<0.05)。圖2 表油菜素內酯對砷抑制水稻幼苗地上部相對增長量的緩解作用Fig.2 Effects of epibrassinolide on alleviation of inhibition of relative growth of aerial part of rice seedlings under arsenic stress

不同小寫字母表示不同處理間差異達到顯著水平(P<0.05)。圖3 表油菜素內酯對砷抑制水稻幼苗地上部干質量的緩解作用Fig.3 Effects of epibrassinolide on alleviation of inhibition of dry weight of aerial part of rice seedlings under arsenic stress

2.2 表油菜素內酯對砷處理下水稻砷積累和轉移能力的影響

AsIII處理后水稻根系和地上部總砷含量分別為(14.34±3.85) mg/kg和(5.96±3.59) mg/kg，外施油菜素內酯后總砷含量分別降至(13.07±2.43) mg/kg和(5.70±0.53) mg/kg，但差異不顯著。此外，與單獨AsIII處理相比，外施表油菜素內酯可降低根系對砷的吸收能力[SAU值從(22.23±9.21) mg/kg降至(18.74±5.78) mg/kg]，但卻增加了砷向地上部轉移的能力(TF值從0.399±0.087升至 0.459±0.121)。

2.3 表油菜素內酯對砷處理下水稻根系細胞膜透性的影響

根系細胞膜透性可通過伊文思藍染色來定性比較，未受損的完整細胞膜不會吸收伊文思藍，但當細胞膜受損后，伊文思藍就會進入細胞并與蛋白質結合。因此，染色顏色越深表明細胞膜透性越大，細胞受損越嚴重。從圖4可見，與CK相比，AsIII處理的幼苗根尖有明顯被染色的現象，呈現藍色的區域多且染色深，而AsIII+外施EBR處理的根系染色較淺并且染色區域較少。這表明AsIII脅迫處理可導致幼苗根系細胞膜受損進而透性增大，但噴施外源EBR后可有效緩解亞砷酸鹽對根系的損傷。此外，與CK相比，AsIII處理后水稻根系的相對電導率顯著增加，提高了59.4%，但外施表油菜素內酯后相對電導率顯著下降(比單獨AsIII處理降低了55.4%)(圖5)。因此，AsIII處理可致使水稻根系細胞的膜系統受到嚴重損傷，但外施表油菜素內酯可在一定程度上減輕AsIII脅迫對根系的傷害。

圖4 砷與表油菜素內酯處理下水稻幼苗根系的伊文思藍染色Fig.4 Evans blue staining of rice seedling roots under arsenic and epibrassinolide treatments

不同小寫字母表示不同處理間差異達到顯著水平(P<0.05)。圖5 砷與表油菜素內酯處理下水稻幼苗根系的相對電導率Fig.5 Relative electrical conductivity in roots of rice seedlings under arsenic and epibrassinolide treatments

2.4 表油菜素內酯對砷處理下水稻葉片活性氧含量的影響

從圖6可以看出，與CK相比，AsIII處理的葉片上具有明顯的棕色條帶，且葉脈上染色更明顯，說明組織中H2O2含量較高，而外施EBR后葉片上幾乎沒有棕色染色條帶，與對照相近。NBT染色可直觀呈現葉片中集聚超氧陰離子的部位，從而推測葉片的過氧化損傷程度。與CK相比，AsIII處理的葉片上有大范圍的藍色沉淀，而外施EBR后葉片上的藍色沉淀顯著減少，且顏色較淺(圖7)。

圖6 砷與表油菜素內酯處理下水稻幼苗葉片的DAB染色Fig.6 DAB staining of leaves of rice seedlings under arsenic and epibrassinolide treatments

圖7 砷與表油菜素內酯處理下水稻幼苗葉片的NBT染色Fig.7 NBT staining of leaves of rice seedlings under arsenic and epibrassinolide treatments

2.5 表油菜素內酯對砷處理下水稻根系脯氨酸和NPT含量的影響

亞砷酸鹽處理導致根系中脯氨酸含量極顯著上升，與CK相比提高了587.7%,但外施表油菜素內酯后脯氨酸含量顯著下降，比單獨AsIII處理降低了24.0%，但仍然高于CK(圖8)。從圖9可知，與CK相比，AsIII處理后根系中NPT含量顯著上升，提高了108.9%,但外施EBR后根系中NPT含量顯著下降，比AsIII處理降低了43.7%，幾乎恢復到CK水平。

不同小寫字母表示不同處理間差異達到顯著水平(P<0.05)。圖8 砷與表油菜素內酯處理下水稻幼苗根系中脯氨酸含量的比較Fig.8 Comparison of proline contents in roots of rice seedlings under arsenic and epibrassinolide treatments

不同小寫字母表示不同處理間差異達到顯著水平(P<0.05)。圖9 砷與表油菜素內酯處理下水稻幼苗根系中NPT含量Fig.9 NPT content in roots of rice seedlings under arsenic and epibrassinolide treatments

2.6 表油菜素內酯對砷處理下水稻根系中砷吸收轉運等相關基因表達的影響

OsLsi1、OsPIP2;4、OsNIP2;2、OsPT8是水稻中負責亞砷酸鹽和砷酸鹽吸收的主要基因，OsLsi2主要將吸收的砷卸載到木質部進而向地上部轉運，OsHAC4可將砷酸鹽還原為亞砷酸鹽[16-17]。從圖10可以看出，噴施外源表油菜素內酯后，OsLsi1、OsPIP2;4和OsPT8的表達量在砷脅迫處理后12 h出現顯著下調表達，而OsLsi2和OsHAC4的表達量卻一直高于單獨AsIII處理。因此，噴施EBR降低了水稻幼苗根系對砷的吸收和轉運，同時增加了幼苗自身的解毒能力，但卻增加了砷在地上部中的積累。

圖10 砷與表油菜素內酯處理下水稻幼苗根系中砷吸收轉運等相關基因的相對表達量Fig.10 The expression level of genes involved in arsenic uptake and translocation in roots of rice seedlings under arsenic and epibrassinolide treatments

3 討 論

油菜素內酯除參與調控植物生長發育外，還在植物響應外界逆境脅迫中發揮著重要作用[28-29]。李錢峰等[30]報道，施用外源油菜素內酯不僅可促進植物生長，而且在高鹽和干旱等逆境條件下可有效緩解逆境脅迫造成的植物損傷。砷是類金屬元素，高濃度砷可導致植物葉片黃化、卷曲甚至地上部死亡等[31]。本研究結果表明，砷處理下水稻的生長發育受到明顯抑制，但是噴施0.1 μmol/L表油菜素內酯有效促進了亞砷酸鹽脅迫下水稻幼苗的生長，且在一定程度上增加了地上部干物質的積累，這表明噴施外源表油菜素內酯可提高水稻幼苗對砷毒害的耐受能力。

砷對植物細胞的毒害作用往往表現在對膜系統的氧化損傷等方面，因此根系細胞膜系統是防御外界污染物的重要屏障[32-33]。大量研究結果證明，根系相對電導率的高低是判斷植物是否處于逆境傷害的一個重要生理指標，被廣泛應用于植物抗性生理研究中。在重金屬脅迫下，植物細胞膜透性增大，電解質大量外滲，從而影響細胞膜內外的物質交換，引起離子平衡失調，生理代謝紊亂，嚴重時導致細胞膜的解體和細胞死亡[34]。另外，伊文思藍染色能定性比較不同外界逆境脅迫下植物幼苗根系細胞的受損程度[35]。本研究發現，使用亞砷酸鹽處理一定時間后，水稻幼苗根尖細胞膜系統嚴重受損，且伴隨細胞外滲物增多，導致相對電導率顯著上升。這與郭暉等[36]的研究結果相一致。同時，我們也發現，施加外源表油菜素內酯可顯著減輕砷脅迫下水稻幼苗根系細胞膜系統的受損狀況。由此可見，噴施外源表油菜素內酯對砷脅迫下的水稻幼苗根系膜系統具有保護作用。

在逆境脅迫下，植物體內會產生大量O2·-、H2O2等活性氧自由基[37]。這些自由基具有很強的氧化活性，能夠破壞植物體內的氧化還原平衡，進而對植物造成傷害[38-39]。DAB染色和NBT染色結果表明，砷脅迫可導致水稻幼苗葉片發生過氧化損傷，影響水稻幼苗的正常生長，而外施表油菜素內酯會明顯減輕砷脅迫下水稻葉片中活性氧自由基的產生和積累。油菜素內酯之所以具有提高植物抵抗逆境的能力，可能是因為其可激活植物中的抗氧化酶保護系統, 從而盡快消除植物體內由于逆境而產生的過多有害自由基[40]。

脯氨酸是公認的植物應答逆境脅迫的重要可溶性有機滲透調節物質，在保護生物膜完整性和維持生物膜透性以及細胞正常膨脹狀態方面具有重要作用[41-42]。在逆境條件下，大量游離脯氨酸會在植物體內積累，且其積累指數與植物的抗逆性相關。本研究發現，當受砷脅迫時，水稻根系中脯氨酸大量積累，而砷處理結合外施表油菜素內酯處理下根系中脯氨酸含量降至對照水平，這表明外施表油菜素內酯會影響逆境條件下水稻根系組織中氨基酸代謝水平。

大量研究結果顯示，NPT在植物重金屬解毒方面具有重要作用。NPT能絡合亞砷酸鹽(三價砷)并通過離子泵將其儲存在液泡中，限制其向地上部運輸，致使其在水稻體內的移動性下降，降低其毒性[43-44]。三價砷對多肽上的巰基(-SH) 具有高親合力，一旦與蛋白質上的-SH結合后，會影響其正常結構與功能，這是亞砷酸鹽導致水稻植株毒害的主要原因[45]。本研究發現，水稻幼苗受到亞砷酸鹽脅迫后其根系中NPT含量顯著增加，但施用亞砷酸鹽后結合表油菜素內酯處理的水稻根系中NPT含量與對照差異不明顯，但其機理尚待進一步研究。

通過分析水稻根系中負責亞砷酸鹽和砷酸鹽吸收及向地上部轉移和積累相關基因的表達水平，發現不同處理條件下OsLsi1、OsPIP2;4、OsNIP2;2、OsPT8等基因的表達模式截然不同，尤其在表油菜素內酯處理后12 h，OsLsi1、OsPIP2;4、OsPT8的表達顯著下調，表明外施油菜素內酯會降低水稻根系對培養介質中砷的吸收。OsLsi2是控制砷向木質部卸載和籽粒積累的重要基因。我們發現，在亞砷酸鹽與表油菜素內酯組合處理下，OsLsi2的表達量要高于單獨砷處理，表明外施表油菜素內酯會促進砷向地上部轉移。OsHAC4是砷酸還原酶基因，可將砷酸鹽還原為亞砷酸鹽[7,12]。我們發現，OsHAC4的表達量可被外施表油菜素內酯顯著誘導表達，說明砷處理下外施表油菜素內酯可能促進水稻根系中AsV還原為AsIII，而后者與NPT等結合儲存在液泡中從而減輕砷對水稻的毒害。