甘藍晚抽薹基因BoFLC3克隆、序列分析和亞細胞定位

戴忠良，陳 麗，山 溪，秦文斌，肖 燕，朱建飛

(1.江蘇丘陵地區鎮江農業科學研究所,江蘇 句容 212400；2.南京農業大學園藝學院，江蘇 南京 210095)

甘藍(BrassicaoleraceaL.)為十字花科蕓薹屬的重要蔬菜作物，在中國廣泛種植。抽薹開花是其生產中重要的農藝性狀。“先期抽薹”降低產品的產量和品質，是春季結球甘藍生產的主要問題。培育晚抽薹品種是解決這一問題的根本途徑[1-2]。

FLC是開花時間調控的開關基因，對擬南芥開花控制有決定性的作用[3-4]。該基因在白菜類作物中有4個同源基因，但這些同源基因如何調控抽薹，以及它們與其他主要的抽薹開花相關基因的相互關系尚不明確。FLC編碼1個MADS-box蛋白,是開花的負調控因子，很多控制開花的基因功能都是通過調節FLC來實現的，對開花的抑制程度與其表達量呈正相關[4]。FLC可能通過阻遏開花信號途徑來抑制植物的生殖生長。在擬南芥中，己經克隆到了一些與FLC同源的基因，如MAF5、FLM、MF2和FLK等，它們在植物開花過程中也起著負調控作用[5]。FLC及其同源基因抑制一組開花促進因子的表達，如FT和SOC1，這些因子的表達又能夠促進一些分生組織特征基因LFY與AP1的表達[4]。FLC是開花調控過程中起決定因素的一個調控因子，它受GA、光周期、春化與自主途徑的負調控，受FRI-依賴途徑的正調控[6]。遺傳與分子生物學研究結果表明，FRI自主途徑可能是通過與SUF4等形成蛋白復合體結合到FLC啟動子的區域，來影響FLC的染色體結構；春化可使FLC的第一個內含子和啟動子區H3K9和H3K27二甲基化水平增加，使得FLC的染色體結構處于關閉狀態，從而調控FLC的表達[7]。為了更好地利用這些基因對甘藍抽薹開花進行調控，本試驗克隆了與抽薹相關的基因BoFLC3的全長，并對其進行序列分析以及時空特異性表達和亞細胞定位分析，為進一步利用該基因進行甘藍抽薹的調控提供理論和技術支持。

1 材料與方法

1.1 植物材料與菌株

供試甘藍種子由鎮江市農業科學研究所提供。大腸桿菌菌株JM109由本實驗室保存，質粒載體pMD18-T、TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、RNA酶抑制劑、dNTP、AMV反轉錄酶等均購自TaKaRa公司。RNA提取試劑盒(RNA Simply Total RNA Kit)購自TIANGEN BIOTECH公司；Biospin膠回收試劑盒(BioSpin Gel Extraction Kit)購自博飛公司；SYBRPremixExTaqTM試劑盒購自TaKaRa公司。

1.2 BoFLC3基因克隆

以甘藍葉片cDNA為模板，參照甘藍FLC3基因(GenBank登錄號AAP31677)，設計正反向引物BoFLC3-F/BoFLC3-R(表1)，以反轉錄的cDNA為模板進行擴增反應。反應體系為25.00 μl，其中加入10×Taqplus buffer 2.50 μl，25 mmol/L MgCl21.50 μl，10 mmol/L dNTP 1.00 μl，10 μmol/L正向引物1.00 μl，10 μmol/L反向引物1.00 μl，菌液1.00 μl，滅菌H2O 16.75 μl，Taqplus DNA polymerase 0.25 μl(5 U/μl)。PCR反應程序為94 ℃預變性2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環，72 ℃延伸10 min。擴增產物在1.2%瓊脂糖凝膠中進行電泳，凝膠成像分析系統進行拍照及分析。

表1甘藍BoFLC3基因克隆引物

Table1PrimersforthecloningofBoFLC3geneinBrassicaoleracea

引物 引物序列 作用 BoFLC3-F5'-ATGGGAAGAAAAAAACTAGAAATCA-3'基因全長克隆BoFLC3-R5'-TCAGCTTCGGCTCCCGCAAGATTCT-3'BoFLC3-qF5'-ACCTTCTCCAAACGACGCA-3'熒光實時定量引物BoFLC3-qR5'-AGACAACGAGAAGCGCGATG-3'GAPDH-qF5'-TCCACCATTGATTCTTCTCTG-3'熒光實時定量內標引物GAPDH-qR5'-TCAGCCAAATCAACAACTCTC-3'

1.3 目的片段回收

目的片段的回收按照購自博飛公司的Biospin膠回收試劑盒(BioSpin Gel Extraction Kit)使用說明進行。參照TaKaRa生物公司的pMD18-T kit提供的方法，向10 μl的反應總體系中加入1 μl pMD18-T vector,4 μl回收并純化的DNA片段以及5 μl Ligation solution Ⅰ，于16 ℃連接過夜。轉化大腸桿菌。用高溫高壓滅菌的牙簽挑取單菌落，將挑過菌的牙簽置于2 ml LB液體培養基中，在37 ℃，200 r/min條件下振蕩培養12 h。序列測定由南京金思特生物科技有限公司完成。

1.4 序列分析

通過美國國家生物技術信息中心(NCBI)服務器，對核酸序列數據庫進行BLAST搜索，尋找同源序列。將編碼的氨基酸序列用NCBI提供的BlastP程序進行同源性分析，用DNAman軟件對BoFLC3編碼的氨基酸序列進行系統樹分析，利用ProtParam[8]分析BoFLC3蛋白的理化性質，利用TMpred[9]和ANTHEPROT分析軟件分析蛋白質的跨膜區域，利用ProtScale[8]分析蛋白質的親水性區域，用SignalP v3.0[9]進行信號肽分析，利用SMART軟件(http://smart.embl-heidelberg.de/)對甘藍BoFLC3蛋白進行功能域預測分析，蛋白質二級結構預測和三維建模分別使用在線軟件SOPMA(http://npsa-pbi.libcp. fr/cgi-bin/secpred-sopma. pl)和SWISS-MODEL完成。

1.5 實時定量PCR分析

將甘藍材料播種于裝有經過高溫高壓滅菌的基質的穴盤中，將穴盤置于光照12 h、黑暗12 h光周期的光照培養箱中，夜溫20 ℃、晝溫25 ℃下培養。待幼苗長至2片真葉時用于試驗。本試驗用GAPDH為內參基因(表1)，每個cDNA樣品重復3次，根據標準曲線和定量報告進行試驗體系評價和目的基因表達分析。使用Opticon MonitorTM 1.02軟件(MJ Research)對BoFLC3基因相對表達含量進行分析。

1.6 亞細胞定位分析

利用Gateway技術，將上一步的PCR回收產物與入門載體pdonr221和表達載體pEarlyGate101分別進行BP和LR重組反應。轉化大腸桿菌感受態，將有擴增產物且片段大小正確的克隆進行測序。測序驗證后即獲得重組質粒 (亞細胞定位載體) pEarlyGate101-BoFLC3-YFP。然后，利用液氮凍融法將重組融合表達載體pEarlyGate101-BoFLC3-YFP轉入農桿菌GV3101。將含有表達載體pEarlyGate101-BoFLC3-YFP的GV3101農桿菌單菌落接種于含卡那霉素的YEB培養基中，28 ℃，180 r/min培養20 h。然后加入1%體積的菌液到同樣的YEB培養基中，28 ℃，200 r/min培養至菌液OD600為1.0。在4 000 r/min下離心15 min，收集菌體細胞，用終濃度為10 mmol/L 的MgCl2，10 mmol/L MES (調節pH至5.7)，150 μmol/L 乙酰丁香酮的注射緩沖液重懸至OD600為1.0，室溫放置5 h后，用1 ml的無針頭注射器將含有pEarlyGate101-BoFLC3-YFP的農桿菌菌液注射煙草葉片，用H2B-RFP作為細胞核標記。注射后的煙草植株置于25 ℃，16 h/8 h的光/暗周期下培養3 d。在激光共聚焦顯微鏡下觀察YFP熒光信號及H2B-RFP紅色細胞核熒光信號，進行BoFLC3蛋白的亞細胞定位分析。

2 結果與分析

2.1 甘藍抽薹相關基因BoFLC3的全長克隆及拼接

根據甘藍BoFLC3基因序列設計引物，擴增出甘藍BoFLC3基因片段。結果(圖1)表明：該基因全長為570 bp。

M：DL2000。圖1 甘藍BoFLC3基因的PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification results of BoFLC3 gene in cabbage

2.2 甘藍抽薹相關基因BoFLC3序列的生物信息學分析

2.2.1 甘藍BoFLC3蛋白的理化性質分析 對BoFLC3基因所編碼氨基酸序列(圖2)的理化性質進行分析得到，BoFLC3基因編碼197個氨基酸，其蛋白質分子量為20 990；等電點為9.45，說明該蛋白呈堿性；負電荷氨基酸(Asp+Glu)26個，正電荷氨基酸(Arg + Lys)34個；摩爾消光系數0.219(胱氨酸全按半胱氨酸計)；該蛋白不穩定性參數46.88，屬于不穩定蛋白；其脂肪系數96.93；平均親水性(GRAVY)-0.521；序列N末端為Met，推測其半衰期在網狀細胞中為30 h，在酵母中大于20 h，在大腸桿菌中大于10 h。

2.2.2 甘藍BoFLC3編碼的氨基酸序列同源性及進化樹分析 在NCBI站點上用BLAST分析BoFLC3基因編碼氨基酸序列與其他植物抽薹相關基因的同源性，結果(圖3)表明，BoFLC3基因與已克隆的植物的抽薹相關基因均有不同程度同源性，與不結球白菜的控制抽薹基因堿基序列相似性高達94%，與擬南芥(同源蛋白編號AAV51217) 控制抽薹基因堿基序列相似性為79%。DNAman軟件對BoFLC3及其他植物抽薹相關基因的氨基酸序列進行系統樹分析，結果(圖4) 顯示，BoFLC3基因與不結球白菜最先聚為一類，親緣關系最近，而后與蘿卜聚為一類。與擬南芥(AAV51217)，白芥(ABP96967)親緣關系相對較遠。

圖2 BoFLC3的核苷酸序列(上列)及其編碼的氨基酸序列(下列)Fig.2 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequences of BoFLC3

圖3 不同植物BoFLC3基因編碼的氨基酸序列同源性比較Fig.3 Alignment of predicted amino acid sequences of BoFLC3 genes from different plants

圖4 不同植物BoFLC3編碼的氨基酸序列的系統樹分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of the deduced amino acid sequences of BoFLC3 in different species

2.2.3 甘藍BoFLC3蛋白疏水性及跨膜結構域的預測和分析 蛋白質的疏水性分析是蛋白質二級結構以及三級結構預測中一個必要的過程，通過分析可以得到蛋白質的親疏水區域，一方面可以為二級結構預測結果提供參考，另一方面還可以為結構域以及功能域的劃分提供依據。因此，對甘藍BoFLC3氨基酸序列進行疏水性分析，結果 (圖5) 表明，在該蛋白35～50 aa處有1個顯著疏水峰，其他區域以親水性為主。跨膜結構域是膜中蛋白與膜脂結合的主要部位，一般由20個左右的疏水氨基酸殘基組成，形成α螺旋，與膜脂相結合。預測和分析跨膜結構域，對認識蛋白質的結構、功能、分類以及在細胞中的作用部位均有一定的意義。利用TMpred在線軟件預測甘藍BoFLC3蛋白的跨膜螺旋區域，該軟件預測得分超過500的區域為可能的跨膜螺旋區域，符合該條件的區域為35～57 aa處膜外向膜內的跨膜螺旋(圖6)，被賦予的分值為942(34～59 aa處膜內向膜外的跨膜螺旋，賦予分值為895)。跨膜區域位于膜結構中，應為蛋白質的疏水區域。上述預測的跨膜螺旋與ProtScale預測的蛋白質疏水區對應。因此，被預測的跨膜螺旋區可信度較高。

圖5 甘藍BoFLC3蛋白的疏水性分析Fig.5 Hydrophobicity analysis of BoFLC3 in Brassica oleracea

圖6 甘藍BoFLC3蛋白的跨膜螺旋區分析Fig.6 TMpred output for BoFLC3 in Brassica oleracea

2.2.4 甘藍BoFLC3蛋白二級結構的預測分析 多肽鏈借助氫鍵排列成沿一維方向呈現有規則重復構象的二級結構，是氨基酸順序與三維構象之間的橋梁。二級結構借助范德華力、氫鍵、靜電和疏水等相互作用形成蛋白質的三級結構，從而發揮正常的生物學功能。據此，用SOPMA對甘藍BoFLC3蛋白的氨基酸序列進行二級結構預測，結果 (圖7) 表明，BoFLC3蛋白含有比較豐富的二級結構，由120個氨基酸殘基組成α螺旋結構，占全部氨基酸殘基的60.91%；24個氨基酸殘基組成延伸鏈，占全部氨基酸殘基的12.18%；由10個氨基酸殘基組成β轉角，占全部氨基酸殘基的5.08%；由43個氨基酸殘基組成隨機卷曲，占全部氨基酸的21.83%。可以看出，隨機卷曲和α-螺旋是BoFLC3多肽鏈中的主要結構元件，β轉角和延伸鏈散布于整個蛋白質中。

圖7 甘藍BoFLC3蛋白質的二級結構 Fig.7 The secondary structure of BoFLC3 in Brassica oleracea

2.2.5 甘藍BoFLC3蛋白的功能域預測分析 利用SMART軟件對甘藍BoFLC3蛋白進行功能域預測分析，結果(圖8)表明，該基因為MADS盒基因，其編碼的蛋白1～60 aa屬于MADS盒基因蛋白，MADS-box基因是一個序列特異的調節基因家族，其編碼的MADS-box蛋白轉錄因子以二聚體化的形式通過保守的MADS結構域與特定的DNA序列結合來調控基因的表達，通過反向平行的α-螺旋二聚體結構與DNA小溝相互作用。MADS-box基因編碼一類轉錄調控因子，是一類調節植物發育的重要基因，在決定植物開花時間和花形態建成中起著非常重要的作用。

圖8 BoFLC3蛋白的功能域預測分析Fig.8 Prediction analysis on functional domains of BoFLC3 protein

2.3 BoFLC3基因在甘藍不同組織中的特異性表達

如圖9所示，BoFLC3基因的表達在甘藍不同組織中存在顯著的差異，抽薹后，根中表達量最少，花蕾與花瓣中的表達量相近且略低于莖部中的表達量，葉片中表達量最高。

圖9 實時定量PCR檢測分析BoFLC3基因在不同組織中的表達Fig.9 Real-time quantitative PCR analysis of BoFLC3 gene expression in different tissues

2.4 亞細胞定位分析

將含有pEarlyGate101-BoFLC3-YFP的農桿菌侵染煙草植株36 h后，利用熒光共聚焦顯微鏡觀察本氏煙葉片中的熒光。結果見圖10，在激光共聚焦顯微鏡下，試驗組pEarlyGate101-BoFLC3-YFP侵染煙草植株在YFP激發光下可以檢測到較為明顯的黃色熒光信號，紅色熒光信號表示本氏煙植株細胞核位置；2張熒光信號重疊表明BoFLC3定位于細胞核，這與該基因發揮轉錄因子功能以及編碼蛋白質的功能性質有關。

圖10 BoFLC3在本氏煙葉片細胞中的定位Fig.10 Subcellular localization of BoFLC3 in leaves of Nicotiana benthamiana

3 討 論

以擬南芥為模式作物，對其不同生態型和突變體的研究結果表明，基因FLC可能是春化反應的關鍵基因[6]。研究發現，FLC的表達水平與植株低溫處理的時間呈負相關，低溫處理時間越長，FLC的表達越弱，去甲基化也可能對FLC起負調控的作用[5-6]。同時FLC也存在于自主開花途徑中，與其他基因共同作用以調節植株開花時間[10]。而FLC的表達對開花起抑制作用。一系列研究結果表明，春化的低溫作用導致相關基因的去甲基化，消除了FLC對開花的抑制作用，從而解除對赤霉素合成途徑的封鎖最終導致植株在一定時期開花[11]。

本試驗利用RT-PCR技術從甘藍中克隆了BoFLC3基因，在NCBI站點上用BLAST分析BoFLC3基因編碼的氨基酸序列與其他植物抽薹相關基因的同源性，結果表明BoFLC3基因與已克隆的植物的抽薹相關基因均有不同程度同源性，與不結球白菜的控制抽薹基因堿基序列相似性高達94%，與擬南芥(AAV51217)控制抽薹基因堿基序列相似性為79%。利用熒光定量PCR就BoFLC3基因在不同組織中的轉錄表達進行了分析，結果表明，該基因在甘藍植物體內的表達有普遍性。低溫處理后不同組織BoFLC3的表達量從高到低依次為：葉>莖>花蕾>花瓣>根。通過亞細胞定位分析，結果表明，BoFLC3蛋白定位在細胞的細胞核，這與BoFLC3的轉錄因子功能相吻合。

本研究利用PCR方法研究了甘藍抽薹相關基因BoFLC3的時空特異性表達，通過亞細胞定位分析了BoFLC3在細胞中的表達,為下一步研究甘藍中其他抽薹功能基因提供了經驗和技術基礎。