超聲波聯合一磷酸腺苷(AMP)對雞胸肉的嫩化效果

張 坤，吳海虹，鄒 燁，王道營，徐為民,3

(1.江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇 南京 210046；3.江蘇省肉類生產與加工質量安全控制協同創新中心，江蘇 南京 210095)

雞肉具有高蛋白、低脂肪、富含微量元素及礦物質等優點，但雞胸肉相較于雞腿、雞翅等，其肌纖維密度大且纖維直徑寬等原因導致肉質老、嫩度差、口感不好等，這在一定程度上限制了雞胸肉的銷量，目前亟需恰當的處理方法提高雞胸肉的食用品質，以提高肉雞產業的經濟效益,促進肉雞產業的快速穩定發展。目前關于改善雞肉肉質的方法較多，主要包括電刺激嫩化法、生物酶嫩化法[1]、復合嫩化法[2-3]等。其中超聲波是近年來應用較廣的一種嫩化方法，其空化效應、機械效應等能在極短時間內破壞肌肉結構,縮短肌肉僵直期，快速嫩化肉品，Chemat等[4]及秦衛東等[5]的研究結果均表明超聲波的嫩化作用明顯，但是所需超聲功率較大，超聲時間較長，引起肉品表面結構的變化，導致肉品感官評價不佳，消費者滿意度不好，影響肉品銷售及產業發展。本課題組近年來研究發現，一磷酸腺苷(5′-Adenosine monophosphate, AMP)在食品加工中通常作為畜禽肉類的風味改性劑或食品添加劑，已被證實適當的添加有助于肌肉快速解僵，嫩化效果明顯[6-8]。目前，超聲波與其他嫩化方法共同作用的復合嫩化法效果較好，應用較廣。本研究將超聲波與AMP這2種新型嫩化方法復合使用嫩化雞胸肉與超聲波及AMP單獨使用處理雞胸肉等作對比，通過分析雞胸肉肌原纖維小片化指數(MFI)、剪切力、組織切片、超微結構等，研究超聲波與AMP復合嫩化雞胸肉的方法是否具有可行性，為深入了解肌肉嫩化機制，改善肌肉品質與風味及開發肌肉嫩化方法提供新的思路和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本試驗所采用的雞胸肉購自江蘇蘇食食品有限公司，剔除表面結締組織和肌膜后，待用。

一磷酸腺苷由美國Sigma公司生產，預染寬范圍標準蛋白由加拿大Fermentas公司生產。

1.2 儀器與設備

超聲波細胞破碎儀由寧波新芝生物科技股份有限公司生產，T-25型數顯勻漿機由德國IKA公司生產，HI-9025酸度計由意大利Hanna公司生產，UniCenMR冷凍離心機由德國Herolab公司生產，多功能酶標儀由美國Biotek儀器有限公司生產，冷凍干燥機由德國CHRIST公司生產，Q20差式量熱掃描儀由美國TA公司生產，Mini-PROTEAN Tetra Cell垂直電泳系統由美國Bio-Rad公司生產，JS-680C全自動凝膠成像分析儀由上海培清科技有限公司生產，Nikon Eclipse E100正置光學顯微鏡由日本尼康公司生產，NIKON DS-U3成像系統由日本尼康公司生產，EVO-LS10掃描電鏡由德國ZEISSE Oberkochen公司生產等。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗材料處理 選取大小、薄厚相近的雞胸肉，切成 5 cm×5 cm×2 cm的塊狀 [(50±5) g]，從中隨機選取25塊分別做以下處理：第一組不做任何處理放置30 min，作為對照，標記為“CK”；第二組經去離子水腌制30 min，標記為“水”；第三組超聲波處理(功率：300 W，時間：5 min)后經去離子水腌制25 min，標記為“水+U”；第四組經32 mmol/L AMP腌制30 min，標記為“AMP”；第五組則先經超聲波處理(功率：300 W，時間：5 min)后用32 mmol/L AMP腌制25 min，標記為“AMP+U”。每組處理做3個平行。

1.3.2 肉品pH測定 稱取不同處理雞胸肉各2 g，用手術刀切碎成肉糜置于離心管中，加入18 ml去離子水，冰浴均質(3 000 r/min, 10 s)后用酸度計測定其pH，測定3次取均值。

1.3.3 肌原纖維小片化指數測定 參考Culler等[9]的方法并稍作修改測定肌原纖維小片化指數：稱取2 g肉糜，加入20 ml MFI提取緩沖液(0.1 mol/L KCI, l mmol/L NaN3，7 mmol/L KH2PO4,18 mmol/L K2HPO4，1 mmol/L MgCl2, 1 mmol/L EGTA, pH7.0 , 4 ℃)，冰浴均質(12 000 r/min, 30 s, 2次)，冷凍離心(12 000g, 15 min, 4 ℃)，沉淀加20 ml MFI提取緩沖液再次離心(12 000g, 15 min, 4 ℃)，沉淀加25 ml MFI提取緩沖液，攪勻，經2層紗布過濾，濾液即為肌原纖維蛋白(Myofibrillar protein，MP)溶液。

MP溶液用考馬斯亮藍試劑盒測定蛋白質濃度，調整MP濃度為0.5 mg/ml，立即用多功能酶標儀測定其在 540 nm處吸光值，測定3次取平均值。

MFI=OD540×200

1.3.4 過濾殘留量的測定 采用冷凍干燥法：稱取不同處理雞胸肉各5 g，加入20 ml 0.02 mol/L的pH 7.5的磷酸緩沖液，勻漿(16 000 r/min， 30 s)后離心(2 000g，15 min)，沉淀再加入20 ml 0.02 mol/L的pH 7.5的磷酸緩沖液，勻漿(16 000 r/min， 30 s)后離心(2 000g，15 min)。收集沉淀加入20 ml 0.5 mol/L NaCl溶液，勻漿后用一層紗布過濾，再用0.5 mol/L的NaCl溶液重復2遍，收集紗布上沉淀冷凍干燥，稱質量。

1.3.5 熱力學性質變化分析 以量熱差式掃描儀測定樣品TG/DSC曲線，由變性溫度(Tg)表征蛋白質樣品的熱穩定性。鋁坩堝中放入12 mg 左右的雞胸肉樣品。溫度 25～105 ℃，升溫速率5 ℃/min，測定其 TG/DSC曲線。通過 TA Universial Analysis 軟件對熱變曲線中的峰進行處理得到熱變性溫度(Tm)，并對其面積積分后得出焓變(△H)。

1.3.6 蒸煮損失的測定 稱取 (50±5) g雞胸肉塊，用濾紙吸干表面水分后稱質量，記錄蒸煮前肉塊質量m1。然后將肉塊置于自封袋中，將數顯溫度計插入肉塊中央。在95 ℃水浴鍋中加熱至中心溫度75 ℃，立即取出流水沖至室溫，再次用濾紙吸干表面水分后稱質量，記錄蒸煮后肉塊質量m2。根據蒸煮前后肉塊質量計算肉塊蒸煮損失率。

蒸煮損失率=(m1-m2)/m1×100%

1.3.7 剪切力的測定 測定雞胸肉塊剪切力：將方法1.3.6中蒸煮后的肉塊用手術刀和直尺沿肌纖維方向切割成 3 cm×1 cm×1 cm大小肉條，使用TVT-300XP質構儀連接的刀片式探頭，垂直肌纖維的方向進行剪切，測定其剪切力變化曲線，記錄最大剪切力值，每塊肉條測量3次，多次測量取平均值。剪切力測定參數設定為：預試速度：10 mm/s，測試速度：2 mm/s，測后速度：10 mm/s，距離：30 mm，觸發力：50 g 。

1.3.8 肌原纖維蛋白的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析 取100 μl方法1.3.3中提取的MP溶液，加入20 μl上樣緩沖液后滅酶(95 ℃，5 min)，離心(12 000g, 5 min)，取上清液用于SDS-PAGE。采用變性不連續電泳，12%分離膠，5%濃縮膠[丙烯酰胺∶甲叉雙丙烯酰胺=36.5∶1.0(質量比)]。每孔等體積上樣25 μl，200 V恒壓約50 min。凝膠塊用考馬斯亮藍染色液染色10 min后取出，加入適量的脫色液，脫色時放在搖床上使脫色更為均勻迅速，1 h后更換脫色液，直至脫色完成，用凝膠成像儀對膠塊進行成像分析，并用ImageJ軟件掃描條帶，得到光密度值用于數據分析。

1.3.9 雞胸肉組織切片分析 將方法1.3.1中經過處理的雞胸肉切成5 mm厚的小塊，用3%的戊二醛固定后做石蠟切片，然后將石蠟切片脫蠟后先后用蘇木素和伊紅染色，之后脫水封片，經正置光顯微鏡鏡檢，采集圖像進行分析。每個樣品做3個重復。

1.3.10 超微結構分析 雞胸肉樣的微觀結構用掃描電鏡(Scanning electron microscopy, SEM)測定。將方法1.3.1中經過不同處理的雞胸肉沿肌原纖維方向切成 5 mm×2 mm×2 mm小塊，用3%戊二醛固定，噴金鍍膜后SEM觀察樣品超微結構。

1.3.11 雞肉嫩度的感官評價 挑選10位受過訓練的學生進行感官評價測試。取標號 1～25的肉樣放入100 ℃沸水中煮至肉中心溫度達到80 ℃，持續10 min使肉完全被煮熟，取出切成 20 mm×10 mm×10 mm 的肉塊，送入感官評價實驗室給每位評價者進行感官評價[10]。

1.4 數據分析

采用 Excel 軟件統計數據。用SPSS18.0 進行單因素方差分析和相關性分析。分析統計圖使用Origin 8.0繪制。

2 結果與分析

2.1 雞胸肉pH

肌肉的pH變化是復雜的生理生化過程，反映了宰后肌肉糖原酵解速率和肌肉中乳酸含量的變化[11]，pH的變化速率和變化程度又和肌肉品質密切相關[12-13]，肌肉成熟期pH升高，肉質變嫩。

如圖1所示，pH值范圍均符合雞胸肉宰后僵直成熟期的pH范圍(5.8～6.5)[14]，不同處理方式的雞胸肉pH差異顯著(P<0.05)。未經任何處理的對照組pH最小，與對照組相比，單獨使用去離子水腌制嫩化與超聲波和去離子水聯合嫩化均能使雞胸肉pH顯著升高，且2種嫩化方法差異不顯著，原理可能與“水震波嫩化”[15]和“注水滾揉嫩化”[16]法相關。超聲波與AMP聯合作用的雞胸肉pH最大且顯著高于其他處理，嫩化效果最佳。這可能是因為AMP可以與肌肉中的肌動球蛋白某些結合位點結合發生作用，促進肌動球蛋白解離為肌動蛋白等[17-18]，從而加快肌動球蛋白解離速度，使雞胸肉pH顯著上升。另外，現有研究結果證實超聲波處理能加快肌肉宰后成熟速度，加速肌動球蛋白解離，糖原酵解速度加快，促進雞胸肉pH的顯著升高。超聲波處理和AMP處理對雞胸肉的嫩化均有顯著效果，二者聯用效果更佳。

CK:對照；水：去離子水腌制30 min；水+U：超聲波處理后去離子水腌制25 min； AMP：一磷酸腺苷腌制30 min；AMP+U：超聲波處理后一磷酸腺苷腌制25 min。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖1 超聲波和AMP處理對雞胸肉pH的影響Fig.1 Effects of ultrasound and 5′-adenosine monophosphate(AMP) treatments on pH of chicken breast

2.2 雞胸肉MFI

肌肉的MFI是衡量宰后肌肉肌原纖維完整程度的參數，是表征肌肉嫩度的重要指標，肌原纖維結構越破碎，肌肉的MFI值越大，肌肉嫩度越好[19]。如圖2所示，AMP與超聲波聯合處理的雞胸肉MFI與其他處理差異顯著。去離子水處理和單獨AMP處理之間差異不顯著，但與對照間差異顯著。可能是超聲波的“空化效應”和強穿透力使肌纖維在短時間內被破壞，肌原纖維斷裂為肌節小片，使用超聲波處理的雞胸肉MFI值較對照組差異顯著。另一方面，AMP與肌原纖維中的肌動球蛋白作用，促進肌動球蛋白快速解離為小分子的肌動蛋白和肌球蛋白，破壞了肌原纖維蛋白的完整程度，利于肌原纖維小片化指數的增加，因此超聲波與AMP聯用使肌原纖維小片化指數顯著增大，雞胸肉嫩化效果較好。

CK、水、水+U、AMP、AMP+U見圖1注。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2 超聲波和AMP處理對雞胸肉MFI的影響Fig.2 Effects of ultrasound and AMP treatments on muscle fibrillation index(MFI) of chicken breast

2.3 過濾殘留量

過濾殘留物是結締組織和肌原纖維中不溶性蛋白的混合物，不容易被勻漿分離，能較好的反應肌肉中不溶性蛋白的含量[20]。從圖3可以明顯看出，超聲波和AMP處理均能顯著減少雞胸肉的過濾殘留量，復合處理的雞胸肉過濾殘留量最少。超聲波對過濾殘留量產生的作用可能是因為空化效應破壞了肌肉的完整結構，肌肉組織中的內源酶大量釋放，大量降解結締組織，分解部分不溶性蛋白，另外，超聲波的熱效應可能導致膠原蛋白變性，對過濾殘留量的顯著減少有較大貢獻[21]。而AMP的作用比超聲波更明顯，AMP可以與肌原纖維中的蛋白結合從而促使它們降解為分子量較小的可溶性蛋白，過濾殘留量顯著減少，同時，肌原纖維和結締組織的混合物變得容易分離，肌肉韌性減小，嫩度增大。

CK、水、水+U、AMP、AMP+U見圖1注。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖3 超聲波和AMP處理對雞胸肉過濾殘留量的影響Fig.3 Effects of ultrasound and AMP treatments on filter residue of chicken breast

2.4 雞胸肉DSC變化

不同處理的雞胸肉差式量熱掃描熱流曲線如圖4所示，在每條熱流曲線上都可以看出2個明顯的峰，峰Ⅰ和峰Ⅱ分別代表了肌球蛋白和肌動蛋白熱變性引起的熱流變化[22]。表1顯示，超聲波和AMP處理的雞胸肉熱變性溫度Tm右移，焓變呈增大趨勢,肌球蛋白和肌動蛋白的熱變性溫度均高于對照，表明超聲波和AMP處理對肌動蛋白和肌球蛋白的熱穩定性具有顯著影響，可能是超聲波及AMP處理使蛋白空間立體性增加，構象變化引起相變，改變了肌肉蛋白質的高級結構[23]，或者肌原纖維蛋白骨架降解，肌原纖維蛋白粗細絲即肌動蛋白和肌球蛋白間的間距增大，肌肉柔軟性增加，嫩度得到改善。

從下到上曲線分別為對照組CK和S、S+U、AMP、AMP+U的熱流曲線圖。CK、水、水+U、AMP、AMP+U見圖1注。圖4 雞胸肉的差式量熱掃描圖Fig.4 Differential scanning calorimetry thermogram of chicken breast

表1超聲波和AMP對雞胸肉變性溫度和變性焓的影響

Table1EffectsofultrasoundandAMPtreatmentsonthermaldenaturationtemperatureanddenaturationenthalpyofchickenbreast

處理方式 T1(℃)△H1(J/g)T2(℃)△H2(J/g)CK58.211.10978.250.3525水58.121.31678.290.2489水+U58.161.36778.120.3806AMP59.271.04978.420.3411AMP+U60.231.32278.580.6848

CK、水、水+U、AMP、AMP+U見圖1注。T1和T2分別為肌動蛋白和肌球蛋白熱變性溫度，△H為變性焓。

2.5 雞胸肉蒸煮損失和剪切力變化

圖5為不同處理的雞胸肉蒸煮損失和剪切力變化圖，由圖5可看出，隨處理方式的不同，蒸煮損失和剪切力變化趨勢基本一致。與對照組相比，蒸煮損失由24%降低到了16%，剪切力由1 800 g降低到1 050 g，AMP和超聲波處理均能顯著降低(P<0.05)雞胸肉的蒸煮損失和剪切力，兩者聯合處理的雞胸肉蒸煮損失和剪切力最小。AMP腌制降低肉品的蒸煮損失和剪切力的原因可能是AMP能與肌動球蛋白特異性結合，促進了肌動球蛋白解離，肌動球蛋白解離使肌肉僵直狀態解除，肌肉變柔軟，因此，剪切力顯著降低(P<0.05)，雞胸肉嫩度得到顯著改善。而超聲波處理不僅能破壞肌原纖維蛋白結構并釋放大量鹽溶性蛋白[24]，還能促進鹽溶性蛋白向肌肉表面富集，增強肌肉表面阻止水分外溢的能力[25]，因此超聲波處理使雞胸肉蒸煮損失顯著減小，嫩化效果較好，超聲波處理與AMP聯合處理嫩化效果最佳。

CK、水、水+U、AMP、AMP+U見圖1注。圖5 超聲波和AMP處理對雞胸肉剪切力和蒸煮損失的影響Fig.5 Effects of ultrasound and AMP treatments on shear force and cooking loss of chicken breast

2.6 MP 的SDS-PAGE電泳分析

肌原纖維蛋白主要由肌動蛋白、肌球蛋白等組成，肌球蛋白由2條重鏈和多條輕鏈組成，為大分子蛋白質，在SDS凝膠電泳中只能分別以肌球蛋白重鏈和輕鏈的形式呈現。由圖6可以看出，不同處理間肌動蛋白和肌球蛋白重鏈條帶深淺變化明顯，AMP處理的肌動蛋白含量和肌球蛋白重鏈含量均與其他處理差異明顯(P<0.05)，超聲波與AMP聯合處理的肌動蛋白含量最高，AMP單獨處理的雞胸肉肌動蛋白含量其次，對照和去離子水腌制處理的無明顯差異。這表明AMP處理比超聲波處理對雞胸肉的嫩化效果明顯，可能是AMP與大量肌動球蛋白發生特異性反應，肌動球蛋白大量解離為肌動蛋白和肌球蛋白，而超聲波與AMP聯合處理是超聲波促進了AMP對肌動球蛋白解離的反應，因此，聯合處理的嫩化效果明顯。

1:對照；2：為去離子水腌制30 min；3：超聲波處理后去離子水腌制25 min； 4：一磷酸腺苷腌制30 min；5：超聲波處理后一磷酸腺苷腌制25 min。圖6 雞胸肉肌原纖維蛋白的SDS-PAGE圖(A)和定量分析圖(B)Fig.6 Sodium dodecyl sulfate-gel electrophoresis patterns and quantity analysis of myofibrillar protein in chicken breast

2.7 雞胸肉組織切片

圖7為不同嫩化方式處理后的雞胸肉組織學圖像。圖7A和 圖7B分別為雞胸肉組織縱切和橫切圖，由圖可以看出，對照具有形狀和大小較為一致的圓柱形肌纖維，肌原纖維束完整，纖維間間隔較小且一致，而其他4組處理的肌原纖維結構均遭到一定程度的破壞，可觀察到內容物的釋放和肌原纖維破碎，纖維間間隔增大且不均勻，肌纖維結構不再完整且斷裂為大小不一的碎片，且能在纖維內部看到明顯的空隙。超聲波的空化效應引起肌纖維沿著肌肉組織Z線斷裂，同時造成組織內容物包括內源酶的釋放，增強了組織蛋白酶的活性，對肌纖維結構破壞產生促進作用[20,26]。而AMP本身作為三磷酸腺苷即ATP的分解產物，能與肌原纖維蛋白中的肌動球蛋白產生特異性反應，促進肌動球蛋白解離，破壞肌原纖維結構，當人為添加AMP作為嫩化劑，AMP的作用更為明顯，這也合理解釋了圖7Ae和圖7Be即超聲波與AMP復合應用組的纖維斷裂程度最顯著，肌原纖維破碎明顯且片段小而均一，其次，超聲波與AMP單獨處理的也出現肌纖維較顯著斷裂。這也證實了上述肌原纖維小片化指數的結論。肌纖維結構破碎和纖維間間隔變化對肉類嫩化有良好的促進，使肌肉具有更好的食用效果。

a：CK；b：水；c：水+U；d：AMP；e：AMP+U。 CK、水、水+U、AMP、AMP+U見圖1注。圖7 雞胸肉組織肌原纖維縱切圖(A)和肌原纖維橫切圖(B)Fig.7 Tissue section of chicken breast

2.8 雞胸肉超微結構

通過掃描電鏡拍攝到不同處理的雞胸肉的超微結構如圖8所示。由圖8可知，對照的雞胸肉結構完整，肌纖維緊密規則排列，肌原纖維完整且相互之間基本沒有空隙、孔洞，圖8b顯示，雞胸肉因水浸泡腌制表面吸水膨脹，但仍可以看出肌原纖維結構完整未受到損壞，圖8c顯示，超聲波處理的雞胸肉可以明顯看出肌纖維束分布不再均勻，部分肌纖維出現長度、直徑差異，說明超聲波對肌原纖維結構有一定的破壞作用，可能是超聲波的機械效應和空化效應的作用使肌肉結構變松散，部分肌原纖維遭到“聲波”的巨大沖擊而斷裂[27-28]，而作用不很明顯的原因可能是超聲波處理時間太短。AMP浸泡腌制的雞胸肉(圖8d)和復合處理的雞胸肉(圖8e)肌纖維結構完整性遭到嚴重破壞，完整且粗壯的肌原纖維變為短小、破碎的肌原纖維碎片，且復合處理組的肌原纖維破碎更顯著，這是因為高濃度的AMP與肌肉中大量肌動球蛋白發生特異性反應造成大分子量的蛋白質解離[29]，肌原纖維變得松散無序，肌肉因此柔軟，嫩度好。

a：CK；b：水；c：水+U；d:AMP；e:AMP+U。 CK、水、水+U、AMP、AMP+U見圖1注。圖8 超聲波和AMP處理的雞胸肉的掃描電鏡圖Fig.8 The scanning electron microscopy photographs of chicken breast in the treatments of ultrasound and AMP

2.9 雞胸肉感官評價

感官評價分值(表2)表明16號、6號和24號雞胸肉的嫩度感官評價最好，12號、17號和1號感官評價最低。對應地得出對照嫩度最差，而AMP和超聲波聯合嫩化的雞胸肉嫩度最好的結論，與各樣品剪切力值得出的結論基本一致，因此，感官評價能分辨出雞胸肉之間的嫩度差異，但分辨率較剪切力等不明顯。

3 結 論

本試驗對未處理的對照和經超聲波、AMP等不同嫩化處理的雞胸肉進行對比分析，結果表明，超聲波和AMP處理均可使雞胸肉pH和MFI升高，過濾殘留量減少且顯著減小蒸煮損失和剪切力，使肉品熱敏性、組織學結構和表面微觀結構發生明顯變化，肌動蛋白和肌球蛋白含量顯著增大(P<0.05)，從而改善雞胸肉嫩度。但仍需進一步試驗證實超聲波與AMP聯合對肌肉的嫩化效果與肌動球蛋白解離的關系及其復合嫩化方法的優化，確定肌動球蛋白解離與肌肉嫩化及超聲波嫩化與AMP嫩化之間的關系，這將有助于更清楚地了解肌肉的宰后成熟機理，為改善禽類肉品品質提供新的方向和方法。

表2各肉樣的剪切力值和感官評價值

Table2Shearforceandsensoryevaluationofchickenbreast

處 理剪切力值(g)感官評價(分)樣品號CK11 7693421 74911231 72511741 75222351 74011水11 70432221 73041831 6873341 72132551 698413水+U11 48371921 5037731 47381441 4856851 50672AMP11 55251121 5625931 56341541 5324551 541521AMP+U11 21391621 1549631 18282041 17092451 201710

表中感官評價分值為1～9分，感官評價分值均為平均值。CK、水、水+U、AMP、AMP+U見圖1注。