用于檢測轉基因作物中調控元件的質粒標準分子的構建

邢宇俊，陸丹丹，吳季榮，徐劍宏，王園園，梁 杰，史建榮

(江蘇省農業科學院農產品質量安全與營養研究所/江蘇省食品質量安全重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地/農業部農產品質量安全控制技術與標準重點實驗室/農業部農產品質量安全風險評估實驗室/江蘇省轉基因安全評價公共服務中心/江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心/中德農產品質量安全評估技術研發中心,江蘇 南京 210014)

自從首例轉基因產品被批準商業化生產以來，轉基因作物在不同的國家和地區開始大規模地商業化種植，截至2017年，全球24個國家轉基因作物種植面積達到 1.898×108hm2[1]。越來越多的已批準的轉基因農產品出現在市場上，比如：轉基因玉米、大豆、油菜、苜蓿、木瓜、棉花、甜菜、馬鈴薯等[1]。但隨著轉基因作物在全球范圍內迅速發展，其環境和食品安全性問題一直受到人們的關注，因此，對轉基因農產品的檢測有利于政府職能部門對其進行監管和監督。

目前，轉基因作物檢測的常用方法是提取檢測樣品的DNA，進行定性PCR[2]或定量PCR檢測[3]。在PCR檢測過程中，必須設置陰性對照和陽性對照，確保檢測結果的可比性、溯源性，標準物質的作用十分重要[4-5]。檢測結果的可靠性、準確性、有效性需要陽性標準物質(包括標準質粒)作對照，因此陽性標準物質在轉基因農產品檢測中是不可缺少的。

雖然現在轉基因的轉化體比較多，但市場上銷售的標準物質種類有限，價格比較高，很多標準品來自歐盟標準物質與測量研究所(IRMM-CRL) 和美國油料化學家協會( AOCS)，種類主要包括轉基因玉米、大豆、油菜、水稻、棉花、甜菜等60余種[6]。而國內這些標準物質主要依賴于進口，而且以植物原材料制備標準物質非常復雜，不僅需要精密的儀器設備，而且對環境要求也比較高。雖然國內也有部分轉基因標準物質商業化，例如由中國計量科學研究院研制的Bt63，但種類有限。這些標準物質針對的是特定品系。根據轉基因產品的特征，檢測方法等，建立了相關的數據庫，例如由上海交通大學建立的GMDD(http://gmdd.shgmo.org/)，以及歐盟轉基因實驗室建立的ENGL (http://gmo-crl.jrc.ec. europa .eu/engl/engl. html)。通過比較轉基因品系外源基因的信息，發現它們自身包含1種或幾種特定的啟動子或終止子，并不涵蓋多個啟動子或終止子。玉米中常使用的調控元件是CaMV35S啟動子(35S)、NOS啟動子(PNOS)、FMV35S啟動子(FMV35S)、PTA 29啟動子(PTA29)、Ubiquitin啟動子(Ubiquitin)、35S終止子(t35S)、nos終止子(tNOS)、E9終止子(tE9)。因此，選擇這些調控元件構建陽性質粒，可以更好地用于農產品中轉基因成分的檢測。

陽性標準質粒分子的構建是采用目的外源基因片段進行特異性擴增，重組于質粒分子上，轉入微生物中進行大量培養。優點是質粒DNA容易提取且純度高，穩定性好，并且一個質粒分子中可以包含多個外源目的基因[7]。可以有效解決陽性標準品缺乏和陽性標準品制備困難的問題，因此被稱為“金標準物質”[8]。

隨著國內外對轉基因檢測要求的不斷提高，檢測方法開始從定性PCR向定量PCR轉變，用質粒分子作為定量標準物質易于操作。現階段，國內質粒分子標準物質已經在玉米[9-10]和大豆[11]轉基因檢測中得到很大的發展，并且已有質粒分子標準物質(MON810)申請了有證標準物質[12]。但是這些研究是針對一種轉化體或一類作物，而在沒有標準物質的經濟作物、蔬菜、未知材料的檢測時，需要通用型標準物質。因此，本研究根據轉基因品種調控基因的特性，將多個啟動子和終止子整合到質粒分子中，構建標準質粒分子，用于大多數已經批準的轉基因作物的檢測和監管。

1 材料與方法

1.1 植物樣品與試劑

TaqDNA聚合酶購自Promega生物技術(美國)有限公司，植物基因組提取試劑盒購自Axygen生物技術有限公司，質粒提取試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司，DNA marker、dNTPs、pMD-19T購自TaKaRa生物工程(大連)有限公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。大腸桿菌DH5a菌株本實驗室保存。轉基因大豆品系GTS 40-3-2、MON87705、MON89788和A5547-127，轉基因玉米品系Bt11、MON810、Bt176、NK603和TC1507，轉基因油菜品系GT73、MS1、RF1和Oxy235，購于美國AOCS公司和上海佑隆生物有限公司。轉基因水稻KF6和TT51-1由農業部科技發展中心提供。

1.2 質粒pMD-RG的設計

針對國內外檢測標準中通用元件基因，構建含有一批啟動子(花椰菜花葉病毒35S啟動子CaMV35S、玄參花葉病毒35S啟動子FMV35S、煙草花藥組織特異基因TA29啟動子 PTA29、玉米泛素蛋白基因啟動子Ubiquitin、胭脂堿合成酶基因NOS的啟動子PNOS)和終止子(花椰菜花葉病毒的35S終止子t35S、胭脂堿合成酶基因NOS終止子tNOS、豌豆1,5-二磷酸核酮糖羧化酶E9基因終止子tE9)的多靶標調控原件標準質粒分子，命名為pMD-RG。設計的質粒圖譜及大小見圖1。

1、2、3、4、5分別代表啟動子CaMV35S、FMV35S、PTA29、Ubiquitin、PNOS，6、7、8分別代表終止子t35S、tNOS、tE9。圖1 重疊PCR法構建標準質粒的示意圖Fig.1 Diagram of standard plasmid constructed by overlapping PCR

1.3 質粒pMD-RG的構建

根據CaMV35S、FMV35S、PTA29、Ubiquitin、PNOS、t35S、tNOS、tE9的相關序列信息以及國家標準中使用的引物序列，添加合適的引物互補接頭(表1),利用重組PCR技術將相鄰片段連接起來，構建示意圖見圖1。首先用引物35S-F/35S-FMV35S-R擴增CaMV35S啟動子，用引物FMV35S-F/FMV35S-PTA29-R擴增FMV35S啟動子，將兩部分擴增產物作為模板，用引物35S-F/FMV35S-PTA29-R進行重組PCR，從而將CaMV35S啟動子和FMV35S啟動子2個片段連接在一起，以CaMV35S+FMV35S表示；同樣的方法獲得PTA29+Ubiquitin、PNOS+t35S和tNOS+tE9。再以CaMV35S+FMV35S和PTA29+Ubiquitin擴增產物為模板，用引物35S-F/Ubiquitin-PNOS-R進行重組PCR擴增，獲得CaMV35S+FMV35S+PTA29 +Ubiquitin片段；以PNOS+t35S和tNOS +tE9的擴增產物為模板，利用引物PNOS-F/tE9-R 進行重組 PCR 擴增，獲得PNOS+t35S +tNOS+tE9,最后以CaMV35S+FMV35S +PTA29+Ubiquitin和PNOS+t35S+tNOS+tE9的擴增產物為模板，利用引物35S-F/tE9-R進行重組PCR擴增，獲得CaMV35S+FMV35S+ PTA29+Ubiquitin +PNOS+t35S +tNOS+ tE9的整體序列，用于質粒分子調控元件的構建。將構建好的質粒轉入大腸桿菌感受態細胞DH5a中，挑選單克隆在LB培養基(含有Amp)中培養，培養條件200 r/min，16 h。提取質粒進行驗證。

表1重組PCR引物

Table1OverlappingPCRprimers

啟動子和終止子 引物名稱 引物序列(5'→3') 擴增片段大小(bp)CaMV35S35S-FGCTCCTACAAATGCCATCATTGC19535S-FMV35S-RggtggatgtcttGATAGTGGGATT GTGCGTCATCCCFMV35SFMV35S-FAAGACATCCACCGAAGACTTA210FMV35S-PTA29-RccacccaccttaAGGACAGCTCTTTTCCACGTTPTA29PTA29-FTAAGGTGGGTGGCTGGACTA266PTA29-Ubiquitin-RcttgccagtgttACTTGCACCACAAGGGCATAUbiquitinUbiquitin-FAACACTGGCAAGTTAGCAAT314Ubiquitin-PNOS-RacgtaaaacggcCCGTAATAAATAGACACCCPNOSPNOS-FGCCGTTTTACGTTTGGAACTG183PNOS-t35S-RcatgagcgaaacTTATGGAACGTCAGTGGAGCt35St35S-FGTTTCGCTCATGTGTTGAGC121t35ST-tNOS-RgcaacaggattcGGGGATCTGGATTTTAGTACTGtNOStNOS-FGAATCCTGTTGCCGGTCTTG180tNOS-tE9-RccaatgccataaTTATCCTAGTTTGCGCGCTAtE9tE9-FTTATGGCATTGGGAAAACTGT273tE9-RATATATTCTTCGGTCATTAGAGGC

引物中小寫部分為接頭。

1.4 重疊PCR擴增

用添加互補接頭的特異性引物分別擴增出含有接頭的基因片段。PCR體系：10×PCR buffer 2.500 μl，Mg2+2.500 μl，dNTPs(2.5 mmol/L)2.000 μl，上游引物 0.750 μl，下游引物 0.750 μl，DNA模板(50～100 ng)1.250 μl，TaqDNA聚合酶0.125 μl，補水至25.000 μl。反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，循環35次；72 ℃延伸7 min。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳分析，將獲得的正確片段條帶進行切膠回收。

將含有互補接頭的膠回收產物進行連接，進行重疊PCR。PCR體系：10×PCR buffer 2.50 μl，Mg2+2.50 μl，dNTPs(2.5 mmol/L)2.00 μl，DNA模板各1.00 μl，TaqDNA聚合酶0.25 μl，補水至25.00 μl。反應程序：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火10 min，72 ℃延伸3 min，循環15次；72 ℃延伸10 min。反應體系中添加第1段基因的正向引物和第2段基因的反向引物，其他反應體系和條件不變。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳分析，將獲得的大小正確的條帶進行切膠回收。膠回收產物即為2個片段的連接產物。

1.5 重組片段克隆與驗證

PCR擴增得到的特異性片段與pMD19-T載體連接，連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞DH5a，涂布含Amp的LB固體培養基，37 ℃培養12 h。挑取單菌落，進行PC擴增驗證和測序驗證。

PCR 擴增驗證：利用表2中不含接頭的引物對標準質粒pMD-RG的外源插入基因進行驗證，檢驗所構建的質粒是否能夠擴增預期的所有片段。PCR反應體系和反應條件同方法1.4中含有接頭的基因片段的擴增，利用2%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物，比較目的基因擴增產物同預期片段大小是否一致。

測序驗證：由生工生物工程(上海) 股份有限公司完成質粒分子的測序驗證。測序結果分別同NCBI進行blast，驗證載體中序列的準確性。

1.6 pMD-RG質粒分子檢驗及應用

按照標準物質的國家標準JJG 1006-1994[13]，對構建的標準質粒pMD-RG進行均勻性和穩定性檢驗。

均勻性檢驗：取樣方法按國家標準JJG 1006-1994 技術規范進行。將稀釋至1 μl 1×106拷貝的質粒溶液以500 μl分裝至凍存管中，共分裝300 管。從中隨機取10 管，分別標記為 1～10，對各管質粒分子中的每個目標片段進行檢測。

穩定性檢驗：對質粒樣品進行短期穩定性比較。將質粒溶液稀釋至1 μl 1×106拷貝，以每管50 μl 分裝至0.2 ml的PCR管內，分別將樣品置于25 ℃、4 ℃、-20 ℃、-70 ℃存放，在第1 d、第7 d、第14 d、第21 d和第28 d時對質粒樣品進行PCR檢測，對樣品的穩定性進行比較。

pMD-RG質粒分子的應用：分別以構建的標準質粒分子pMD-RG和基質標準品中提取的DNA為模板，進行PCR擴增，比較質粒分子中各調控元件的擴增和穩定性與基質標準品是否一致。PCR體系及擴增程序同方法1.4中含有接頭的基因片段的擴增。

2 結果與分析

2.1 重疊PCR擴增獲得的啟動子和終止子重組片段

根據圖1所示，進行載體構建。利用表1中各基因的上游和帶有互補接頭的下游引物分別擴增，PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳分析，結果見圖2。正確的片段切膠回收后，將含有互補接頭的膠回收產物進行連接，以此作為模板進行重疊PCR，電泳后切膠回收獲得連接產物，即為2個片段的連接產物(圖2)。

確定條帶大小正確后，進行切膠回收，再將2個片段連接起來。分別為CaMV35SS+ FMV35S(405 bp)、PTA 29 +Ubiquitin(580 bp)、PNOS +t35S(304 bp)、tNOS +tE9(453 bp)(圖3A、圖3B、圖3C、圖3D)。之后再拼接上述片段，即CaMV35S +FMV35S +PTA 29 +Ubiquitin(985 bp)和PNOS +t35S+tNOS+tE9(757 bp)(圖3E、圖3F)。最后，將2個大片段整合起來，得到完整的8個調控元件的片斷(1 742 bp)(圖3G)。

2.2 轉基因篩查陽性質粒的鑒定

利用分子克隆方法，將重疊PCR擴增獲得的重組片段連接到質粒載體pMD-19T上，構建轉基因篩查陽性質粒pMD-RG。對重組質粒進行鑒定和驗證。

通過紫外分光光度計測量DNA 純度及質量濃度，測定其在260 nm、280 nm處的紫外光吸收值，將質量濃度稀釋為50 ng/μl。測定結果表明，260 nm與280 nm處的吸光值比值在1.80至2.00 之間，260 nm與230 nm處的吸光值比值在2.0至2.3之間，說明DNA 純度符合質粒標準分子要求。

M：DL 2000 bp marker；1：陰性對照；2～5：模板為含有目標基因的轉基因材料；啟動子CaMV35S和終止子tNOS以轉基因大豆GTS40-3-2為模板；啟動子FMV35S、終止子tE9以轉基因油菜GT73為模板；啟動子PTA29以轉基因油菜MS1為模板；啟動子PNOS以轉基因油菜RF1為模板；終止子t35S以轉基因玉米Bt176為模板；啟動子Ubiquitin以轉基因玉米MON810為模板。圖2 轉基因作物中啟動子和終止子的擴增Fig.2 Amplification of promoter and terminator of transgenic crops

M：DL 2000 bp marker；1：陰性對照；2～5：連接后的片段。A:CaMV35S+FMV35S;B:PTA29+Ubiquitin;C:PNOS+t35S;D:tNOS+tE9;E:CaMV35S+FMV35S+PTA29+Ubiquitin;F:PNOS+t35S+tNOS+tE9;G:CaMV35S+FMV35S+PTA29+Ubiquitin+PNOS+t35S+tNOS+tE9。圖3 啟動子和終止子的連接片段Fig.3 The segment connection of promoters and terminators

利用表1中各基因的上、下游引物，對標準質粒pMD-RG的外源插入片段進行驗證[14-15]。結果顯示，擴增條帶片段大小與預期片段大小一致(圖4)，各片段大小分別為CaMV35S 195 bp、FMV35S 210 bp、PTA29 266 bp、Ubiquitin 314 bp、PNOS 183 bp、t35S 121 bp、tNOS 180 bp、tE9 273 bp，表明載體構建成功。同時對質粒分子進行測序驗證(圖4)。BLAST分析結果表明：pMD-RG克隆序列長1 742 bp，與實際堿基序列完全吻合。

a圖中， M為DL 2000 bp marker，NC為空白對照，1～8依次為CaMV35S、FMV35S、PTA29、Ubiquitin、PNOS、t35S、tNOS、tE9；b圖中，下劃線表示質粒標準分子構建中所用的引物位置。圖4 標準質粒pMD-RG的PCR擴增驗證(a)和測序驗證(b)Fig.4 PCR amplification and sequencing validation of standard plasmid pMD-RG

2.3 pMD-RG質粒分子的均勻性和穩定性

將pMD-RG質粒標準分子同一稀釋到1 μl 1×106拷貝，分裝，隨機抽取其中的10管進行均勻性檢驗。PCR擴增結果(圖5)顯示10管質粒標準分子都擴增出對應的8個調控基因片段，說明質粒標準分子各管間均勻性良好。

M：DL 2000 bp marker；1～10：隨機抽取的10管質粒分子。圖5 pMD-RG質粒標準分子均勻性驗證Fig.5 Verification of uniformity of standard plasmid molecules of pMD-RG

對pMD-RG質粒分子進行短期內穩定性檢驗。PCR擴增結果(圖6)表明，pMD-RG質粒分別在25 ℃、4 ℃、-20 ℃、-70 ℃溫度下存放1 d、7 d、14 d、21 d、28 d，擴增結果均很好。說明短期內pMD-RG標準質粒穩定性好，擴增結果可靠。

2.4 pMD-RG質粒分子的應用分析

對構建的質粒pMD-RG進行PCR擴增鑒定。從表2可以看出，質粒pMD-RG中各調控元件均得到了擴增并與基質標準品的結果一致，證明構建的含調控元件的篩查質粒分子pMD-RG可以作為轉基因作物檢測的陽性標準品用于轉基因成分檢測。

表2轉基因作物篩查質粒pMD-RG的PCR擴增鑒定

Table2PCRidentificationofscreeningplasmidpMD-RGfortransgeniccrop

轉基因作物品系CaMV35SFMV35SPTA29UbiquitinPNOS t35StNOStE9Bt11+NN+NN+NBt176+NN+N+NNMON810+NN+NNNNNK603+NN+NN+NTC1507+NN+N+NNA5547-127+NNNN+NNGT73N+NNNNN+TT51-1NNNNNN+NKF6+NNNN++NMS1NN+N+N+NRF1NN+N+N+NGTS40-3-2+NNNNN+NMON89788NNNNNNN+OXY235+NNNNN+N

+:檢測出相應條帶;N:沒有檢測出。

3 討 論

轉基因作物的種植面積在逐年擴大。在中國，每年都有轉基因品系獲得進口證書，2017年農業部發布轉基因生物安全證書(進口)清單，批準孟山都、拜耳、先正達等公司的16個轉基因生物安全證書(進口)，涉及的轉基因生物為大豆、玉米、油菜、棉花、甜菜，用途皆為“加工原料”[16]。截至目前，中國進口的轉基因產品擴大到46種，對這些獲得進口證書的轉基因產品的監管比較嚴格。然而，對進口產品中混雜的非法進口的轉基因品種或實驗室產品擴散的監管更為重要。對于未知產品的檢測，當前采用的主要方法是通用元件基因檢測，之后對轉化體品系進行分析。在檢測過程中，陽性標準物質是檢測過程中的標尺，然而由于來源于植物原材料本身的標準物質的制備過程非常復雜，需要精度很高的設備，生產成本較高，保存環境要求高等因素，獲得所有不同轉基因植物的標準樣品難度比較大[17]。而標準質粒分子是一種重組質粒分子，根據需要可組合轉基因作物的內源基因，待檢測的外源基因，轉化體特異性片段，該物種特異性片段，也可插入多組外源基因，并且制備上操作簡便，生產成本低，容易獲得高純度質粒標準分子DNA樣品[18]。因此含有通用元件的質粒作為陽性對照在檢測中使用比較便捷。

在質粒構建過程中，如果選擇常規的質粒載體構建方法，一般利用酶切位點進行重組克隆，而有時酶切的選擇和位點引入存在一定難度，同時在構建過程中要進行多次酶切和連接操作，這使得構建過程繁雜而且構建成本也較高[19]。本研究中選擇的重疊PCR技術比較方便快速。重疊PCR最初是用于基因定點突變中[20]，后來被擴展應用到2個片段的拼接[21]。該技術也曾在其他質粒分子的構建中使用，設計的引物中有18～25個堿基重疊，重疊序列能將相鄰的8個目標DNA片段連接[22]。本研究將8個調控元件單獨擴增后，利用重疊PCR技術將這些調控元件片段融合在一起，進行克隆，構建了含有8個調控元件的質粒載體，相對于引入酶切位點的重組克隆，該技術更便捷快速。

本研究構建的含有調控元件的標準質粒均勻性一致，短期穩定性好。已構建好的標準質粒分子可以在低溫環境下(4 ℃、-20 ℃、-70 ℃)保存3個月，對檢測結果沒有影響[23-24]。用標準質粒作為標準物質，可以避免在檢測過程中陽性物質的多次提取，減少陽性物質對實驗室的污染。通過分析國外已批準商業化和國內處于環境釋放階段材料的插入元件信息，以及國內檢測標準的需要，選擇轉化體中通用調控元件構建篩查質粒，構建的篩查質粒可以覆蓋絕大多數轉基因轉化體，可作為轉基因產品檢測和監管的對照標準物質。