清熱散結膠囊指紋圖譜技術研究

劉厚權 張俊英 毛艷艷 毛艷峰 胡吉忠 楊濤

（江西普正制藥有限公司 吉安331409）

清熱散結膠囊是采用千里光單味藥材生產的中成藥，具有消炎解毒、散結止痛的作用，可用于急性結膜炎、急性咽喉炎、急性菌痢、上呼吸道炎、急性支氣管炎、急性扁桃腺炎、淋巴結炎、皮炎濕疹、中耳炎等的治療[1]。千里光藥材收載于2015年版《中國藥典》，其主要以金絲桃苷作為指標性成分來控制質量[2]。據文獻報道，千里光藥材中含有槲皮素、木犀草苷、蘆丁、千里光堿、阿多尼弗林堿等成分[3]。清熱散結膠囊以綠原酸為主要指標性成分來進行質量控制，目前的質量標準難以真實反應產品內在品質，因此本研究選擇千里光中多種有效成分如金絲桃苷、槲皮素、綠原酸、木犀草素等[4～5]進行定性分析，并建立高效液相色譜指紋圖譜，以多種有效成分的含量來評價產品的品質，更好的控制產品的質量，保障產品的臨床療效和用藥安全。現報道如下：

1 儀器、試藥與樣品信息

1.1 儀器 AB104-N萬分之一天平（梅特勒-托利多）；AUW2200十萬分之一天平（SHIMADZU）；KQ3200超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；Mili-Q超純水儀（Milipore公司）；Waters2695高效液相色譜儀（Waters公司）。

1.2 試劑 甲醇：分析純，上海振興化工一廠；乙腈：色譜純，山東禹王實業有限公司化工分公司；磷酸：分析純，廣東光華科技股份有限公司。

1.3 對照品 綠原酸：110753-201415，中國食品藥品檢定研究院；金絲桃苷：111521-201507，中國食品藥品檢定研究院；槲皮素：100081-201408，中國食品藥品檢定研究院；木犀草苷：111720-201408，中國食品藥品檢定研究院。

1.4 藥材 千里光藥材購置于樟樹藥材市場，經江西普正制藥有限公司吳永忠研究員鑒定為千里光（Senecio scandens Buch.-Ham）。

1.5 清熱散結膠囊樣品 江西普正制藥有限公司生產的清熱散結膠囊產品，批號有：121101、121102、121103、121104、121201、121202、130702、130703。

2 方法與結果

2.1 樣品的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸、金絲桃苷、槲皮素、木犀草苷對照品2.5 mg，加入75%甲醇50 ml充分溶解、稍振搖，作為對照品溶液。

2.1.2 清熱散結膠囊供試品溶液制備 取清熱散結膠囊內容物1.0 g，精密稱定，充分研磨成細粉后放置于具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇50 ml，稱重，超聲處理（功率 250 W，頻率 50 kHz）30 min，取出，然后冷卻至室溫，用75%甲醇彌補足損失的重量，濾過，取濾液作為供試品溶液。

2.1.3 藥材供試品溶液制備 取千里光藥材1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇25 ml，稱定重量，于75～85℃水浴加熱回流1 h，取出，放冷，用75%甲醇彌補損失的重量，濾過，取濾液作為千里光藥材對照品溶液。

2.1.4 千里光浸膏樣品溶液制備 按照清熱散結膠囊生產制備工藝，取中間產品浸膏粉0.4 g，精密稱定，加入75%甲醇20 ml，稱量，超聲（功率250 W，頻率50 kHz）處理30 min，取出，冷卻至室溫，用75%甲醇彌補足損失的重量，濾過，取濾液作為千里光浸膏粉對照品溶液。

2.2 高效液相色譜條件 儀器：Waters高效液相色譜儀（Waters2695分離單元，Waters2996二極管陣列檢測器，Empower色譜工作站）；色譜柱：ODS-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測波長 0 min∶220 nm，15 min∶280 nm，30 min∶325 nm，40 min∶360 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；流動相：乙腈為流動相A，0.05%磷酸水溶液為流動相B，按表1梯度洗脫。

表1 梯度洗脫體積比濃度配置

2.3 系統適應性 分別取各對照品溶液、清熱散結膠囊樣品溶液、藥材的供試品溶液、千里光浸膏溶液及空白溶液各10 μl，分別注入液相色譜儀中，按照高相液相色譜法進樣測定分析。通過對比各樣品的高效液相色譜圖譜，清熱散結膠囊供試品溶液中只檢出綠原酸，而千里光藥材和浸膏中可以檢出金絲桃苷和綠原酸，兩者均未能檢出槲皮素、木犀草苷、木犀草素。見圖1～圖8。

圖1 清熱散結膠囊樣品色譜圖譜

圖2 千里光藥材

圖3 千里光浸膏樣品色譜圖

圖4 金絲桃苷對照品色譜圖

圖5 綠原酸對照品色譜圖

圖6 槲皮素對照品色譜圖

圖7 木犀草苷和木犀草素混合對照品色譜圖

圖8 空白對照色譜圖

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取批號121104清熱散結膠囊樣品，根據上述樣品溶液制備方法制備清熱散結膠囊樣品溶液，連續進樣5次，將5次進樣供試品樣品HPLC圖譜數據導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》2012年版相似度軟件，進行相似度評價。結果顯示相似度在0.95以上，說明儀器精密度良好。見表2。

表2 連續五次進樣相似度分析

2.4.2 重現性試驗 取批號130702的清熱散結膠囊樣品，根據上述樣品溶液制備方法制備清熱散結膠囊樣品溶液，平行制備溶液6份，連續進樣，將6份進樣供試品樣品HPLC圖譜數據導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》相似度軟件，進行相似度評價。結果顯示相似度在0.95以上，說明本方法重現性良好。見表3。

表3 平行樣品相似度分析

2.4.3 穩定性試驗 取批號121202的清熱散結膠囊樣品，根據上述樣品溶液制備方法制備清熱散結膠囊樣品溶液，分別于 0、2、4、8、12、24 h 后進樣。將6次進樣供試品樣品HPLC圖譜數據導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》相似度軟件，進行相似度評價。結果顯示相似度在0.95以上，說明供試品溶液在24 h內穩定。見表4。

表4 不同時間段相似度分析

2.5 指紋圖譜的建立與分析

2.5.1 指紋圖譜的建立 取8批清熱散結膠囊樣品，根據上述樣品溶液制備方法制備清熱散結膠囊樣品溶液，分別精密吸取供試品溶液5 μl，分別注入液相色譜儀，獲得各批次清熱散結膠囊的HPLC圖譜。將8批清熱散結膠囊圖譜作為清熱散結膠囊參照指紋圖譜。其中共有12個特征共有峰，12個特征共有峰的平均保留時間如表5所示，圖譜總長度為60 min。對比綠原酸對照品圖譜我們得出峰7為綠原酸。見圖9和表5。

圖9 清熱散結膠囊指紋圖譜

表5 特征共有峰保留時間

2.5.2 相似度評價 將8批清熱散結膠囊色譜數據和清熱散結膠囊對照指紋圖譜導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》相似度軟件進行相似度評價。結果顯示不同批次清熱散結膠囊指紋圖譜的相似度大于0.9，說明各批次樣品的化學成分一致性較好，說明江西普正制藥有限公司生產的清熱散結膠囊產品批間穩定性較好，產品質量均一性較好。見表6和圖10。

表6 不同批次清熱散結膠囊指紋圖譜相似度計算結果

圖10 不同批次清熱散結膠囊指紋圖譜相似度評價

3 討論

本研究建立的清熱散結膠囊的高效液相指紋圖譜共有12個特征峰，可以表征產品的有效成分，該方法穩定可靠，重復性較好，可以作為清熱散結膠囊的質量控制方法。本研究結果表明，不同生產批次的清熱散結膠囊指紋圖譜相似度在0.9以上，批次間相似度較好，說明江西普正制藥有限公司生產的清熱散結膠囊批間均一性較好，產品臨床療效穩定，安全性較好。本研究發現，清熱散結膠囊樣品中只檢出綠原酸，而千里光藥材和浸膏中可以檢出金絲桃苷和綠原酸，但未能檢出槲皮素、木犀草苷、木犀草素，這其中的原因還需要進一步研究。