中藥影響缺血-再灌注損傷心肌自噬的研究進展

血運重建是近年來冠心病治療領域的重大進展，國內冠狀動脈血運重建手術逐年增加，2016年我國冠心病介入治療的總例數為666 495例[1]，冠狀動脈血運重建術改善了病人的近期預后與生存質量。但是，血運重建術后近期的再灌注損傷、冠狀動脈無復流，遠期的支架內再狹窄等問題仍存在，影響血運重建的臨床效果及病人的生活質量。近年來，已有不少學者對中藥干預缺血后再灌注損傷的療效及其機制、中藥影響心肌細胞自噬機制進行研究，現將有關進展概述如下。

1 再灌注損傷與心肌自噬

自噬是細胞自我保護機制，自噬是一種溶酶體依賴性降解途徑，其發生與多種分子相關，在心血管疾病發生發展過程中具有十分重要的作用[2]。在基礎狀態下自噬參與內環境穩定及機體生長發育，在構成正常水平的蛋白質質量調控和保持心肌細胞結構及功能方面發揮著重要作用，然而自噬過度或不足導致的異常蛋白質和細胞器的累積，可能直接損傷心肌細胞，導致心臟功能異常。

正常情況下，心肌自噬維持在一定的水平，這種基礎水平自噬是一種分解代謝平衡途徑，對減少心肌細胞死亡，維持心臟功能具有重要作用。心肌細胞的再分化能力非常有限，細胞生存過程中不可避免會產生功能異常或折疊錯誤的蛋白質及細胞器衰老或受損，自噬可以降解細胞內功能異?；蛘郫B錯誤的蛋白質及受損衰老細胞器，為細胞提供能量，促進物質循環及細胞自我更新。在心肌缺血階段，基礎水平的細胞自噬可以降解受損傷的物質，為細胞提供營養物質及能量，從而對缺血心肌細胞起保護作用，避免其壞死或凋亡。若自噬下調，大量有害物質則會在細胞內積聚，會導致細胞受損及死亡，加重疾病的發展。

在某些特殊情形下，細胞自噬水平上調，如在低氧、線粒體功能障礙或感染等情況下，自噬水平增高，從而清除受損線粒體，避免凋亡因子釋放進入細胞質，同時提高細胞對低氧的耐受力，對細胞起一定保護作用；心肌缺血時自噬水平提高，分解受損細胞器或異常蛋白質為心肌代謝提供能量，維持心肌收縮力。自噬上調過度則會誘導細胞進入死亡程序，從而加劇疾病發展，尤其在心肌缺血后再灌注階段，自噬過度激活，反而會降解正常的蛋白質和細胞器，破壞細胞，進而導致不可逆的細胞死亡[3]。

避免過度細胞自噬可保護損傷心肌，減少壞死或凋亡。樊理華等[4]在動物試驗中采用夾閉股動脈的方法制作肢體缺血再灌注模型，觀察心肌細胞凋亡情況以及LC3-Ⅱ的表達情況，發現缺血預處理組(IPR組)細胞凋亡減少(P<0.05)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達下調(P<0.05)，證實了缺血預處理的心肌保護作用，這關鍵在于減輕了大鼠肢體缺血再灌注心肌細胞自噬。王智華等[5]在動物試驗中發現舒芬太尼后處理使LC3-Ⅱ表達減少，并可能通過激活PI3K-Akt通路而抑制自噬水平，從而在心肌缺血再灌注損傷中起到保護作用。葉紅偉等[6]制作離體大鼠心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)模型，觀察自噬在法舒地爾(fasudil)抑制Rho激酶心肌保護中的變化，發現抑制Rho激酶心肌保護作用中誘導了自噬的發生，最終發揮保護心肌作用。Aisa等[7]在心肌梗死動物模型試驗中發現，與假手術組比較，急性心肌梗死(AMI)組左室梗死面積明顯增大，梗死周圍區LC3-Ⅱ表達水平明顯提升，p62明顯增高，相比AMI組，雷帕霉素(RAPA)治療組左室梗死面積明顯減小，梗死周圍區LC3-Ⅱ表達水平明顯提升，p62表達水平明顯降低，表明自噬可減少左前降支結扎后心肌梗死面積，改善心功能。這一研究提示調控缺血心肌的自噬水平，可以起到保護心肌、減輕心肌損傷的作用。

2 細胞自噬與陰平陽秘

細胞自噬是一種細胞維持內環境穩定，抵御損傷的生物機制，有學者運用中醫氣血理論、陰陽平衡理論、痰瘀病因學說對其進行分析。李欣志等[8]認為陰陽自和是人體的一種自主修復能力，當心臟陰陽失和，心肌細胞功能失常或數量減少，則誘發細胞自噬作用，以消除受損細胞器，產生新的營養物質，協助細胞度過缺血期，發揮自我保護作用，認為心肌自噬與中醫陰陽失和存在密切聯系。

黃麗瓊等[9]認為細胞自噬功能可能是氣維持生命活動功能發揮的微觀表現，自噬的過度與不足為氣的陽化和陰化得太過與不及，表現為氣的氣化功能，自噬清除“垃圾”產物并保護受損細胞的機制表現為氣的防御功能，自噬對細胞分子的調控以感應傳導信息，維持和調節內環境穩定則表現為氣的中介、推動和調控作用。黃貴華等[10]認為自噬是對機體正虛邪實做出的一種自我調節方式，是正氣虧虛下的自救方式，也是機體轉化、消除內生邪實的過程。劉杰民等[11]進一步提出，細胞自噬與中醫在氣虛的情況下“精化氣”以維持機體的正常生命活動，以及在臟腑功能失調情況下，內生痰濁瘀血之邪實的自我清除以維持內環境陰陽平衡的機制相一致。以上研究說明心肌自噬與中醫氣虛證候相聯系。

也有醫家認為在細胞自噬的“自我消化”過程中，蛋白質、脂質及糖等飲食精微轉化過量，則生成濁邪，濁邪瘀滯，不能得到及時有效的控制或改善，從而導致痰瘀病理產物[12]。

3 中藥對病理狀態下心肌自噬的影響

有學者已經關注心肌自噬機制與中藥治療心血管疾病療效的關系，并通過在體與離體細胞實驗進行了相關研究。

3.1 中藥復方

3.1.1 加味丹參飲 加味丹參飲以補氣活血為法，由丹參20 g、黃芪20 g、赤芍10 g、檀香6 g、紅花6 g、當歸6 g、川芎6 g等藥組成，饒春梅等[13]將體外培養的H9C2心肌細胞隨機分為6組，建立心肌缺氧/復氧模型，給予空白血清、加味丹參飲含藥血清、3-甲基腺嘌呤10 mmol/L、雷帕霉素100 nmol/L等處理，觀察心肌細胞自噬體形態及數量變化，各組自噬相關蛋白LC3-Ⅱ及Beclin1表達。結果顯示，與缺氧/復氧組相比，含藥血清組以及含藥血清+自噬激動劑組鏡下心肌細胞變性壞死程度減輕，電鏡下自噬體數量增多，培養液中乳酸脫氫酶(LDH)漏出率明顯降低，LC3-Ⅱ及Beclin-1蛋白表達上升(P<0.05)。提示加味丹參飲可能通過上調自噬相關蛋白LC3-Ⅱ以及Beclin-1的表達，增強細胞自噬，保護損傷的心肌細胞。

3.1.2 痰瘀同治方 痰瘀同治方由瓜蔞、薤白、清半夏、柴胡、赤芍、川芎、黃連、甘草等組成，唐丹麗等[14]研究痰瘀同治方作用機制，動物實驗提示痰瘀同治方通過抑制核轉錄因子-κB(NF-κB)活化，改善心肌細胞凋亡，抑制自噬而達到保護心肌的作用，為進一步探討痰瘀同治方對心肌缺血再灌注損傷(I/R)過程不同階段自噬的調控作用，研究組將預實驗大鼠通過可逆性冠狀動脈左前降支結扎制作心肌缺血(MI)及I/R模型進行實驗，發現與模型組比較，痰瘀同治組能降低缺血期血清肌酸激酶(CK)及再灌注期CK、LDH含量(P<0.05)，抑制缺血期Beclin-1mRNA及再灌注期Beclin-1、LC3mRNA的表達，上調缺血期及再灌注期Bcl-2mRNA表達，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，這表明痰瘀同治方通過促進缺血期自噬發生及抑制再灌注期自噬過表達，同時促進抗凋亡蛋白Bcl-2表達而發揮其對缺血再灌注損傷心肌的保護作用[15]。為闡明其作用機制，研究組緊接著通過體外培養H9C2心肌細胞，各組給予相應方劑腸吸收液18 mg/mL孵育2 h后給予缺氧復氧(H/R)處理，電鏡下觀察細胞自噬體結構，檢測細胞上清液中LDH釋放量和超氧物歧化酶(SOD)活性及細胞內LC3、Beclin-1、P-AMPK和P-mTOR蛋白表達，結果顯示，與H/R模型組比較，各中藥組干預后均能降低LDH、Beclin-1表達，同時痰瘀同治方組可提高SOD活性，抑制LC3高表達，下調p-AMPK水平，并上調p-mTOR蛋白表達，從而表明缺氧復氧可激活心肌細胞AMPK-mTOR信號通路，從而誘導自噬過度表達加重心肌損傷，痰瘀同治方可通過調控AMPK-mTOR通路、抑制自噬而起到心肌保護作用[16]。

3.1.3 芪藶強心膠囊 芪藶強心膠囊具有益氣溫陽、活血通絡、利水消腫的功效，常用于冠心病、高血壓等。Tong等[17]為探討中藥芪藶強心(QLQX)在糖尿病小鼠心功能中的潛在作用及血管緊張素Ⅱ受體1型(AGTR1)和瞬時受體電位1型(TRPV1)在糖尿病小鼠心功能中的作用，對鏈脲霉素(streptozotocin，STZ)誘導的糖尿病小鼠腹腔注射血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)或腹腔注射losartan(Los)來評估AGTR1和TRPV1的活性，并監測心功能及自噬相關標志物，發現在糖尿病小鼠心臟中，TRPV1和自噬標志物表達和自噬溶酶體數量減少，血管緊張素轉換酶1和AGTR1表達增加，用Los阻斷AGTR1模擬QLQX介導的心功能改善，減輕心肌纖維化和啟動自噬，而AngⅡ消除了QLQX在野生型糖尿病小鼠中的有益作用，但TRPV1糖尿病小鼠中未發現，這表明在STZ誘導的糖尿病小鼠中，QLQX可通過調控AGTR1/TRPV1介導的自噬來改善糖尿病心功能。

3.1.4 化痰祛瘀解毒通脈顆粒 化痰祛瘀解毒通脈顆粒是針對痰、瘀、毒三因素組方而成的，本方以丹參為君，川芎、人參為臣，澤瀉、黃連為佐，山楂、紅曲為使。范曉迪[18]小鼠實驗證明本方可以有效改善動脈粥樣硬化(AS)斑塊形成，發揮抗動脈粥樣硬化性疾病的作用。進一步的機制研究結果顯示，化痰祛瘀解毒通脈顆粒具有明顯抗AS作用，該方藥中主要活性成分丹酚酸A(SAA)、小檗堿(BBR)、洛伐他汀(LOV)可能依賴打開AMPK-mTOR、抑制AKT-mTOR信號通路激活自噬途徑，從而抑制模型細胞分泌炎性因子的作用。證實了化痰祛瘀解毒方藥調控細胞自噬，可能是發揮抗AS作用的重要途徑之一。

3.1.5 血府逐瘀湯 血府逐瘀湯是著名活血化瘀方劑，臨床用于治療多種心血管疾病。Shi等[19]將H9C2細胞進行缺氧/復氧培養，在不同濃度的血府逐瘀湯下培養12 h，測定細胞活力、LDH釋放到細胞外液中的量，證實了血府逐瘀湯對H/R細胞模型的保護作用，檢測細胞凋亡以及H9C2細胞的自噬水平及相關通路，結果顯示，血府逐瘀湯處理后明顯抑制H/R誘導的自噬，自噬體形成減少，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin-1表達減少，另外血府逐瘀湯抑制自噬可增強細胞活力，減少細胞凋亡，抑制AMPK活化，上調哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)磷酸化作用。這表明血府逐瘀湯在H/R期間的心臟保護作用是通過調控AMPK-mTOR信號通路抑制自噬介導發揮作用的。

3.2 中藥單成分

3.2.1 葒草苷 葒草苷是苗藥都木油的有效成分，具有抗氧化、抗細胞凋亡等藥理作用。劉立亞等[20]在前期研究基礎上進一步采用預給藥方式研究葒草苷對細胞自噬的影響，采用Langendorff法，建立大鼠離體心臟I/R模型，對大鼠預給不同劑量的葒草苷，結果表明，葒草苷可明顯誘導細胞自噬相關蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1表達上升，且增加心肌細胞內自噬體數量，對I/R損傷的心肌細胞起保護作用。此外，通過加用自噬抑制劑渥曼青霉素的方法，發現與葒草苷組比較，加用自噬抑制劑后，心臟血流動力水平降低，心肌酶水平增高，心肌肌纖維紊亂，部分肌絲溶解斷裂，線粒體腫脹，嵴稀疏紊亂，并且使心肌凋亡水平上升，這都從側面證明葒草苷的心肌細胞保護作用可能與細胞自噬有關，但其具體作用機制有待深入研究。

3.2.2 丹參酚酸B 丹參是一種重要的傳統中草藥，具有活血調經、祛瘀止痛、涼血消癰等功效，被廣泛用于冠心病等心血管疾病的治療。丹參的主要水溶性成分之一丹參酚酸B(Salvianolic acid B，Sal B)是丹參最豐富的生物活性成分。Lin等[21]為探討Sal B對大鼠AMI的保護作用及其可能機制，通過動物實驗觀察急性心肌梗死大鼠的病理變化，檢測心肌細胞自噬和凋亡及凋亡相關蛋白、自噬相關蛋白和血管生成相關蛋白的表達。發現與模型組相比，Sal B組心肌梗死明顯減輕，大鼠梗死抑制率較高，梗死面積較小，血清CK、LDH和丙二醛水平下降，而SOD水平明顯升高，Sal B抑制Bax、cleaved caspase-9和cleaved PARP的表達，促進Bcl-2、LC3-Ⅱ、Beclin1和血管內皮生長因子(VEGF)的表達。這表明Sal B對AMI有心血管保護作用。

3.2.3 紅景天苷 紅景天是主要生長于高原地區的一種補氣藥，其主要成分紅景天苷，具有緩解壓力所致的心血管組織損傷及功能紊亂、調節心肌代謝等作用，其作用廣泛，療效明顯。許璨[22]研究認為，高濃度葡萄糖抑制了心肌細胞的自噬，誘導其凋亡，而紅景天苷通過上調mTOR通路恢復心肌細胞自噬活性，拮抗高濃度葡萄糖誘導的凋亡。

3.2.4 九龍藤黃酮(Bauhinia championii flavones，BCF) 九龍藤是廣西特色中草藥，其主要成分九龍藤總黃酮具有較強的抗感染、抗氧化及保護心肌組織急性缺血性損傷的作用。孫瑤[23]以自噬標志物LC3-Ⅱ，自噬相關蛋白Beclin-Ⅰ、mTOR為主要指標，通過大鼠舌下靜脈給藥10 min后冠狀動脈結扎方式建立I/R模型，觀測心肌組織LC3-Ⅱ、Beclin-1、mTOR蛋白表達，實驗發現，BCF可能通過缺血期誘導自噬發生和再灌注期抑制自噬過表達從而發揮抗心肌缺血/再灌注損傷作用，其作用機制可能與下調Beclin-1蛋白表達和上調mTOR蛋白表達有關。

3.2.5 黃芪甲苷(Astragaloside，AS) 黃芪甲苷為黃芪多糖的主要成分，也是中藥黃芪的最主要有效成分。黃莉等[24]在觀察黃芪甲苷對心肌細胞自噬及急性缺血性心肌損傷的治療作用及機制實驗中，通過結扎大鼠冠狀動脈建立心肌缺血再灌注損傷模型，運用細胞生物學及免疫組織化學法，觀察黃芪甲苷處理后的心肌組織損傷、細胞自噬的變化。結果顯示，黃芪甲苷組可使心肌灶性病變和炎癥細胞浸潤的面積明顯減少(P<0.05)，缺血再灌注誘導的心肌組織細胞Beclin1表達降低(P<0.05)。證實了黃芪甲苷可在一定程度上減少缺血損傷的心肌面積，其機制與調節自噬相關基因Beclin1的表達有關。

自噬作為真核內穩定的機制，受精細調控，心肌自噬在缺血性心臟病中的作用關系著發病、病程進展及預后，現有研究提示益氣活血化痰解毒類中藥，可能影響實驗動物的心肌細胞自噬機制，而發揮抗動脈粥樣硬化及保護缺血再灌注損傷的作用，在臨床有效的基礎上，明確益氣活血、化痰解毒中藥的作用機制，對豐富中醫理論，優化提高臨床療效的中藥復方或組分配伍復方具有重要的意義，為中醫藥防治冠心病的藥物開發提供新的思路。