血管平滑肌細胞/內皮細胞miRNA
——中醫藥干預PCI預后的新靶點

經皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)擴大了冠心病(coronary artery disease，CAD)治療領域，但在不斷解決問題的同時也帶來了新的挑戰。最初的單純球囊血管成形術因冠狀動脈的彈性回縮而具有較高的再次介入率[1]。金屬裸支架(bare-metal stents，BMS)植入后血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)異常增殖和遷移引起新生內膜過度增生[2]，由此導致較高概率的支架內再狹窄(in-stent restenosis，ISR)及1年內再次血運重建[3]。藥物洗脫支架(drug-eluting stents，DES)能夠釋放抗增殖藥物，抑制細胞增殖和新生內膜增生，預防再狹窄，降低PCI術后靶病變血運重建率[4-5]，然而，又帶來了晚期支架內血栓等問題[6]。這主要與支架上抗增殖藥物的非選擇性作用有關，其在高效抑制VSMCs增殖和遷移的同時也具有抑制血管再內皮化等相關副作用[7]。PCI術后血管損傷修復是個復雜的過程，諸多細胞參與其中，尤其是VSMCs和內皮細胞(endothelial cells，ECs)扮演著重要角色[8]。人類所有的基因中只有約2%負責蛋白質的產生，而那些從所謂的“非編碼”基因組區域轉錄而來的RNA被稱為非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)。miRNA是ncRNA中重要的一種，大量研究表明，其能夠調控包括參與血管重塑的基因在內的大量基因的表達[9]。中醫藥具有多器官、多途徑、多靶點調節的作用特點，而miRNA調控機體病理生理過程同樣具有多種機制，通過中醫藥調控miRNA水平具有巨大的治療潛力。本研究綜述VSMCs及ECs中miRNA在血管重塑過程中的分子機制中的作用以及中醫藥對其干預作用。

1 VSMCs miRNA概述

成年動物中VSMCs主要表現為收縮和合成兩種表型，在各種刺激下會發生轉換，具有巨大的可塑性。近年來，研究發現，miRNA參與調控了VSMCs的表型轉換，其功能失調與PCI術后ISR等多種血管阻塞性疾病有關[10]。在血管重塑期間，VSMCs從收縮表型轉換到合成表型，大量的VSMCs在內膜中積累，并向中心積聚[11]。目前相關研究已證實了幾種miRNA在VSMCs表型轉換中的調控作用。

1.1 抑制VSMCs增殖的miRNA miRNA是重要的轉錄后調控因子，許多miRNA已經被證實參與調控多種疾病相關基因的表達。其中，miR-143和miR-145是血管發育和血管疾病中VSMCs表型轉換的主要調節因子[12]。Elia等[13]研究表明，miR-145和miR-143基因簇會導致小鼠VSMCs不完全分化，在模型小鼠增殖的VSMCs中水平明顯較低。其他研究也表明，過表達miR-145抑制了大鼠受損頸動脈中的VSMCs增殖和新生內膜形成[14]。多項研究均表明，miR-145/miR-143簇通過對多種靶基因的調控維持VSMCs的收縮表型。如miR-145通過抑制Kruppel樣因子5(Kruppel-like factor 5，KLF-5)調節VSMCs分化標志物，導致細胞增殖和遷移顯著減少[14]。Quintavalle等[15]發現miR-145和miR-143直接以PKC-ε、PDGF受體α(PDGF-Rα)和肌成束蛋白(Fascin)為靶標控制VSMCs小體形成。Cordes等[12]報道Kruppel樣因子4(Kruppel-like factor 4，KLF-4)和ELK-1(ETS癌基因家族成員)也分別是miR-145和miR-143的靶基因。此外，血液中miR-143的水平能夠預測外周動脈閉塞性疾病或CAD病人的支架內再狹窄[16-17]，這些臨床證據進一步證明miR-143/miR-145簇是新生內膜形成的分子機制中的重要一環。

除miR-145和miR-143外，miR-22也在VSMCs分化中起關鍵作用。在最近的一項研究中，Yang等[18]表明miR-22在受損的股動脈中水平下調，其主要靶向調控甲基CpG結合蛋白2(MECP2)、組蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)和親嗜性病毒整合位點1蛋白同源物(EVI1)的3'UTR區；通過功能獲得或功能喪失體內實驗，證明過表達miR-22抑制了VSMCs增殖以及損傷股動脈中的新生內膜形成，低表達則得到了相反的結果。

Torella等[10]在球囊損傷的大鼠頸動脈中觀察到miR-133水平較對照組明顯降低。腺病毒介導的miR-133過表達減少了球囊損傷后的新生內膜形成，低表達結果也從反面加以證實；進一步實驗發現miR-133主要通過靶向調控轉錄因子Sp-1和Moesin，抑制VSMCs的增殖和遷移。臨床研究也表明介入術后低miR-133a濃度水平預示了更高的ISR靶病變血運重建率[19]。

調節VSMCs生理功能和血管再狹窄的其他重要miRNA還包括miR-195。研究表明miR-195通過靶向調控Cdc42、細胞周期蛋白D1和成纖維細胞生長因子1(fibroblast growth factor 1，FGF1)抑制VSMCs的增殖、遷移和促炎生物標志物的表達，而氧化低密度脂蛋白(oxLDL)能夠降低miR-195水平[20]。此外，miR-195過表達能夠抑制大鼠頸動脈損傷后內膜增厚[20]。外周動脈疾病病人行支架植入術后，循環miR-195水平被證明是其2年后靶血管血運重建的獨立預測因子[21]。

相關研究也發現，其他miRNA參與調節VSMCs的表型轉換。miR-23b通過直接調節尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator，uPA)，SMAD家族成員3(SMAD3)和FoxO4來抑制VSMCs的增殖和遷移，過表達miR-23b可顯著降低損傷誘導的新生內膜形成[22]。miR-125a-5p水平在增殖的VSMCs中較低，其負向調節血小板衍生生長因子-BB(platelet-derived growth factor-BB，PDGF-BB)介導細胞的遷移和生長[23]。據報道，miR-663通過靶向調控JunB和肌球蛋白輕鏈9(MLC9)負調節VSMCs的遷移及其分化標記基因在人體中的表達。此外，miR-663的過表達減少了小鼠頸動脈結扎引起的血管損傷后新生內膜病變的形成[24]。

1.2 促進VSMCs增殖的miRNA Ji等[25]實驗表明,miR-21通過直接靶向調控VSMCs的關鍵調節因子磷酸酶與張力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homolog，PTEN)促進VSMCs增殖，進一步研究表明，向受損動脈遞送抗miR-21的反義寡核苷酸可以抑制大鼠的新生內膜形成。相關動物實驗構建ISR模型，最終結果也都證明了miR-21在調節血管對損傷反應中的重要性。McDonald等[26]研究表明miR-21基因消融減少了小鼠血管支架植入后血管炎癥和重塑。Wang等[27]使用抗miR-21涂層支架測試了局部遞送miR-21抑制劑對損傷動脈的影響，結果表明這種方法能夠顯著降低ISR而不影響再內皮化。He等[17]報道，經過血管造影結果判定的再狹窄病人與對照組相比，miR-21循環水平明顯升高，證明miR-21在人體中也起到重要的調節作用。

血管再狹窄中上調的miRNA還包括miR-221和miR-222[28]。這兩種miRNA都能夠促進VSMCs的增殖，其作用部分是通過抑制靶基因p27(Kip1)和p57(Kip2)來實現的。敲低miR-221和miR-222抑制了大鼠血管成形術后頸動脈的新生內膜增生[28]。最近還有研究報道，糖尿病小鼠動脈和VSMCs中miR-221和miR-222的水平增加，抑制這兩種miRNA能阻止糖尿病動脈損傷后VSMCs異常增殖[29]。

miR-31的表達水平在損傷的大鼠頸動脈中顯著增加[30]。大型腫瘤抑制因子2(large tumor suppressor homolog 2，LATS2)通過多種機制抑制細胞生長，而miR-31通過下調LATS2促進VSMCs增殖[30]。此外，miR-31通過下調E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes，CREG)水平，促進人VSMCs轉向合成表型[31]。有研究表明，miR-146a通過靶向KLF4正調節VSMCs的合成表型，過表達miR-146a增加VSMCs增殖，而抑制其在受損大鼠頸動脈中的表達能減少新生內膜增生[32]。Sun等[33]評估了miR-206在VSMCs表型轉換中的作用，研究表明其在受損血管壁的增殖性VSMCs中的表達顯著增加；相反，慢病毒介導的miR-206抑制減少了球囊損傷后的新生內膜形成。miR-181b通過激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路促進VSMCs的增殖和遷移，抑制內源性miR-181b水平能夠抑制血管成形術后大鼠頸動脈的新生內膜增生[34]。

2 ECs miRNA概述

內皮功能對維持血管生理機能和改善支架植入術后遠期預后至關重要。PCI術植入支架后會導致血液剪切應力改變，而ECs能調節血管對剪切應力變化的反應，并且支架術后腔內單層ECs的快速再生對于預防再狹窄和支架內血栓具有重要意義[35]。ECs中表達最高的miRNA是miR-126，其在炎癥反應和內皮功能障礙中扮演了重要角色，缺失會影響受損動脈中的ECs再生，并導致小鼠血管完整性喪失和血管新生減少[36]。miR-126通過抑制蛋白SPRED-1和PIK3R激酶以及炎性細胞因子血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)調節ECs中兩種主要信號通路-血管內皮生長因子(VEGF)通路和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)通路[36]。miR-126也調節ECs對脂質的反應，并通過調節ECs周轉來發揮保護作用[37]。此外，其通過調控活化的白細胞黏附分子(ALCAM)和SetD5來阻止白細胞的黏附，減少單核細胞向被ox-LDL損傷的ECs聚集，以此抑制PI3K/蘇氨酸蛋白激酶(Akt)/核轉錄因子(NF-κB)通路的激活[38-39]。盡管其生物學功能尚未完全闡明，但低水平的miR-126與急性心肌梗死、心力衰竭以及CAD等多種心血管疾病有關[40]。

miR-17/92a簇是CAD中的另一個關鍵調節因子，無論是在缺血和血管損傷的大鼠、小鼠模型中，還是在冠狀動脈搭橋手術后處于運動恢復期間的病人中都能看到其水平上調[41]。miR-92a具有負向調控血管內皮生長的功能；抑制其表達會導致ECs增殖和遷移增加，并促進血管內皮修復[42]。相關研究表明，其通過調控整合素-A5(integrin-A5，ITGA5)減少血管成形術模型大鼠的再狹窄[41]。在股動脈損傷模型小鼠中，抑制miR-92a能加速損傷血管再內皮化，預防新生內膜過度增生，這與其被抑制導致的ITGA5和沉默信息調節因子1(SIRT1)表達水平增加有關[43]。miR-92a在動脈粥樣硬化易感區域分離的ECs中的表達更高，可能是由于其通過微調KLF-2和KLF-4發揮部分促動脈粥樣硬化作用[44]。同時，miR-92a還有調節內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的作用，eNOS負責產生的NO具有抗動脈粥樣硬化特性，進一步證實了其在該過程中的關鍵作用[45]。

miR-221/222也是參與調節ECs產生NO的重要miRNA之一[46]，其在ECs和VSMCs中發揮著明顯不同的特異性調節機制，對ECs的作用主要是抑制增殖和遷移，這種機制在血管病理生理中發揮著關鍵作用[47]。有研究表明，miR-222參與了細胞間交流，其通過內皮細胞外泌體的轉運來遠程調節細胞內黏附分子1(intracellular adhesion molecule 1，ICAM-1)的表達[48]。最近的臨床研究觀察到阿托伐他汀能下調CAD病人內皮祖細胞中miR-221/222的表達，并且與低密度脂蛋白(LDL)水平正相關，表明其參與了他汀類藥物降脂機制[49]。另外，miR-221/222還通過多種途徑參與了ECs凋亡、促動脈粥樣硬化以及血管新生等病理過程的調控[50]。

miR-21在發育、炎癥和心血管疾病等過程中發揮著至關重要的作用[51]。在ECs中，miR-21通過靶向調控PTEN、SMAD7、Ⅰ型和Ⅴ型膠原以及蛋白多糖的表達調控血管新生[52]。此外，miR-21的表達受到單向和振蕩剪切力的調節，并根據具體刺激的不同，其作用可表現為促進eNOS磷酸化、NO產生或者抑制過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPAR-α)表達[53-54]。最近，有研究小組的結果表明高水平的miR-16通過抑制RhoGDIα并降低NO生物利用度，造成后肢缺血模型小鼠內皮修復不良，甚至加重血管損傷反應[55]。miR-16通過調控VEGF、VEGF受體-2(VEGFR2)和成纖維細胞生長因子受體-1(FGFR1)來抑制體外ECs的增殖和遷移，同時還會損害體循環中促血管新生細胞的功能[56]。因miR-16水平與再狹窄風險呈正相關，許多研究者也將其視為肢體血管嚴重狹窄病人預后的可能生物標志物[57]。

3 中醫藥對VSMCs、ECs中miRNA的干預作用

miRNA主要參與調節體內細胞分化、凋亡、增殖等諸多生物學過程。在植物中普遍存在miRNA，中藥來源的miRNA可以通過日常攝食的方式進入人體血液和組織器官，調控人體靶基因表達，進而影響人體生理功能，中藥中miRNA可能是中藥作用的有效成分和物質基礎[58]。中醫藥能通過調控miRNA水平特異性調控ECs和VSMCs的增殖分化。有研究表明，黃芪甲苷可通過調節miR-21的表達，進而影響Akt相關信號轉導通路，促進細胞增殖及血管新生[59]。丹皮酚能夠減輕ox-LDL誘導的血管ECs氧化應激損傷，其主要機制可能是通過下調miR-21的表達水平來提高PTEN的表達，從而抑制p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)通路的磷酸化；上調損傷的miRNA-126水平，從而抑制PI3K/Akt/NF-κB通路，減少VCAM-1的釋放，阻止單核細胞向ECs黏附[60-61]。結扎SD大鼠前降支構建心肌梗死模型，結果發現丹參多酚酸鹽可升高心肌梗死邊緣區miRNA-126表達水平，促進血管新生[62]。將當歸補血湯的有效成分制成控釋微囊，結果表明當歸補血微囊可增強人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)的活力，促進其增殖，并上調miR-21的表達水平，從而促進內皮細胞分裂增殖，誘導血管新生[63]。白藜蘆醇(resveratrol)是虎杖等中藥材的活性成分，有研究顯示其可通過抑制miR-138的表達來抑制在db/db小鼠VSMCs中被高糖所誘導的NF-κB表達的上調，從而抑制db/db小鼠VSMCs的增殖和移行[64]。通心絡在體內和體外均能抑制VSMCs的增殖和遷移，并能逆轉miR-29a對VSMCs的促增殖和遷移作用[65]。

4 小 結

miRNA作為一種重要的ncRNA在VSMCs和ECs中均有較高的存在水平，主要通過調節靶基因表達來調控兩種細胞的增殖和遷移等活動。PCI術后的損傷修復過程極其復雜，也是減少ISR以及改善病人預后的重點關注環節，而VSMCs和ECs是其中的關鍵因素。雖然介入技術不斷發展，手術器械日新月異，但目前仍沒有有效手段去解決促進內皮細胞增殖修復與抑制平滑肌細胞過度增生之間的矛盾。目前的一些研究發現內皮細胞與平滑肌細胞之間通過外泌體交流，而外泌體中發揮重要作用的是miRNA。同時部分miRNA在VSMCs和ECs中發揮著不同的調控作用，這就為探究PCI術后損傷修復問題提供了一個新的研究思路—靶向調控某一種或某幾種miRNA的表達水平，在促進EC增殖遷移以加快內皮修復的同時抑制VSMCs過度增殖，減少再狹窄[66]。另外，中醫藥是我國傳統文化的瑰寶，既往的臨床研究已表明其在干預PCI術后并發癥等方面具有積極的作用，實驗研究也證明了其對VSMCs和ECs的調控作用[67]。中醫藥可能通過多靶點、雙向調節miRNA水平來發揮其特異性調控VSMCs和ECs的功能。目前，已有部分研究表明中醫藥能夠調節miRNA水平，仍需要更多的臨床與基礎實驗去探討中醫藥對miRNA的調控機制，促進中醫藥在干預PCI術后并發癥等方面發揮更大作用。