循環腫瘤細胞在前列腺癌的診斷治療及預后中的作用

陳 凱 孫忠全

復旦大學上海醫學院附屬華東醫院泌尿外科（上海 200137）

世界范圍內，前列腺癌是男性第二大惡性腫瘤以及第五大腫瘤相關性死亡原因[1]。前列腺癌初診時絕大多數是激素敏感型前列腺癌，因此，初診的此類前列腺癌患者主要采用內分泌治療，包括去勢（手術去勢或藥物去勢）及抗雄激素治療等，但是相當一部分患者在經過雄激素剝奪治療后終將進展為轉移性去勢抵抗性前列腺癌 （metastatic castration-resistant prostate cancer,mCRPC）。近年來隨著新型內分泌治療藥物如阿比特龍及恩雜魯胺等的問世，mCRPC患者預后得到很大改善[2]。PSA是前列腺癌診斷、治療及預后判斷過程中最常用標記物之一，而當腫瘤Gleason評分較高或患者進入CRPC階段時，PSA值有時卻和腫瘤負荷及影像學表現不成正比[3]，因此，傳統的PSA檢測已不能滿足對此類前列腺癌尤其是接受新型內分泌治療的患者進行預后的預測和評估。近年來隨著精準醫學的開展，能否找到前列腺癌更好的預測和預后判斷指標，成為了當下熱點問題。

一、循環腫瘤細胞

循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）是指從腫瘤自發脫落或在診療操作過程中進入外周血液循環的完整腫瘤細胞，它來源于原發灶或腫瘤轉移灶。現已證實其是腫瘤血行轉移的重要機制之一[4]。一項由Cristofanilli等進行的研究證實轉移性乳腺癌的患者中，治療前每7.5mL外周血中檢測到5個及以上的CTCs的患者相比外周血中檢測到小于5個CTCs的患者，中位總生存時間（median overall survival,OS）以及中位無進展生存時間 （median progression-free survival,PFS）更短，且差異有統計學意義[5]，這項研究第一次揭示了CTCs的檢測對預測惡性腫瘤的轉移和預后是具有一定價值的。近年來隨著檢測技術的進展，CTCs已應用于臨床多種惡性腫瘤（乳腺癌、肺癌、前列腺癌、結直腸癌等）的分期評估及療效評價[6,7]。

二、循環腫瘤細胞的檢測及富集技術

目前外周血循環腫瘤細胞的檢測技術超過30余種，它們分別具有不同的靈敏度、特異度及可重復利用度[8]，主要包括以聚合酶鏈式反應（PCR）為基礎和以免疫學為基礎的兩大類檢測方法，前者敏感性較高，通過對從血漿或尿液樣本中分離出的核酸進行分析，發現癌細胞在基因組水平和轉錄水平的改變，這一方法不一定要求提取腫瘤細胞，并且可以對癌癥發展和治療過程中發生的變化進行實時的檢測[9-12]，但該方法不能區分活細胞、死細胞及循環分子等；后者主要檢測細胞分子的表面標記物，具有直觀及可被量化的優點，但其無法辨別產生內在變異的腫瘤細胞[13]，該方法往往缺乏一套標準操作流程及規范化的反應試劑,而且價格昂貴。

目前較為成熟的CTC分離及富集技術主要建立在外周血出現上皮來源的腫瘤細胞這一病理現象的基礎上，通過監測上皮細胞表面表達的特異性抗原如細胞角蛋白（CK）、上皮細胞黏附分子（EpCAM）等對CTC進行分離和識別。CellSearch細胞篩選技術是以免疫學為基礎的，是目前美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration,FDA）唯一批準的用于檢測CRPC患者外周血CTC的技術，它正是利用檢測EpCAM等上皮細胞表面抗原的表達來鑒定和富集CTC細胞。但CTC有時存在基因變異而不表達特異的細胞表面抗原，因此僅通過生物化學的檢測方法常常會造成CTC的分離遺漏。

近年來，通過生物物理學方法檢測CTC成為研究的熱點，研究發現CTC細胞通常比循環中的白細胞擁有更大的體積和更小的細胞彈性[14]，通過比對循環腫瘤細胞與血白細胞在細胞大小及細胞形態方面的差異，可將CTC進行分離（盡管CRPC患者的CTC有時并不比白細胞的體積大[15]）。基于此原理，如今科學家們已開發出能使單個細胞通過的濾過膜結構，這類新型的微流體裝置及微濾過裝置的使用將極大推進生物物理學技術在CTC檢測中的應用及發展[16]。

也有學者提出通過密度梯度離心分離并富集CTC等多種方法。以上這些方法可以聯合應用，Myung等通過對癌細胞的多重表面標記物的優化整合，在細胞濾過膜的基礎上，設計出了一種新的多重CTC檢測的方法，其檢測指標包括EpCAM，表皮生長因子受體（EGFR-2）以及和PSA相結合等，這對外周血中數量稀少的CTC及具有高度異質性的CTC的識別或許具有重大意義[17]。

三、CTC計數與轉移性去勢抵抗性前列腺癌的預測與預后

目前CTC檢測主要應用于晚期前列腺癌，特別是mCRPC的診斷及預后判斷。日本的一項多中心研究發現，在CRPC患者中，外周血高CTC計數常常與患者的堿性磷酸酶ALP≥正常值上限（P=0.003），血紅蛋白水平＜11.5 g/dl(p=0.021),PSA≥35 ng/mL(P=0.032)及Gleason score為9～10(P=0.025)等存在相關性，并且同時具有骨和淋巴結轉移的患者治療前中位CTC計數顯著高于僅有骨轉移的患者(P=0.007)。并且外周血基線CTC數量和患者預后相關，外周血基線CTC計數≥5個/7.5mL的患者比少于5個的患者OS明顯縮短（10.5個月vs 25個月）,其次ALP高于正常值上限也是OS更短的獨立預測因素。在經過3個周期的多西他賽化療后，患者CTC計數＜5個/7.5mL提示OS改善（P＜0.003）。根據治療前以及治療后CTC計數，以5為分界值，將患者分為4組，可以發現三個周期多西他賽化療后CTC計數≥5個/7.5mL的患者，不論其治療前外周血CTC計數是否≥5個/7.5mL，患者的中位OS均顯著少于治療后外周血CTC計數＜5個/7.5mL的患者。該篇文章結論指出：3個周期的多西他賽化療結束后外周血CTC計數對化療效果及疾病結局的預測具有重要意義，而化療前患者外周血CTC計數≥5個/7.5mL的患者，往往預示著癌細胞的擴散及化學治療以失敗告終[18]。

此外，也有研究發現，以5個/7.5mL為臨界值的CTC計數比PSA具有更好的預測總生存時間的價值，CTC計數受試者工作曲線下面積明顯大于PSA下降30%組的曲線下面積 （area under the cure，AUC，81%～87%vs 58%～68%），即CTC計數是CRPC患者總生存時間較為精確和獨立的預測因素[19]。Lorente等集中研究了486例前列腺癌患者，這些患者的共同特點是基線CTC計數≥5個/7.5mL外周血，其中122例患者參與了IMMC-38研究 （多西他賽化療），364例患者參與COU-AA-301研究 （阿比特龍用于化療后mCRPC患者），在這486例患者中分別有440例，380例，351例在第4周，第8周，第12周接受外周血CTC計數的檢測，單變量和多變量分析結果顯示在研究的3個時間節點CTC計數較基線值下降≥30%的患者往往有更好的生存獲益。（4周 HR 0.45,95%CI 0.36-0.56，p＜0.001；8周HR 0.41,95%CI 0.33-0.53，p＜ 0.001；12 周 HR 0.39,95%CI 0.3-0.5，p＜0.001）。 并且治療后 CTC 計數較基線下降≥30%與患者生存獲益之間的關系與基線CTC計數的多少無關。這說明CTC計數較基線水平下降30%以上，往往提示患者預后較好。因此外周血CTC計數的動態監測可能對患者接受治療后的療效評價及預后判斷是有所幫助的[20]。

四、CTC細胞表面標記物在前列腺癌診療過程中的作用

晚期前列腺癌患者往往外周血中能不同程度地檢測到上皮來源，間葉來源或者上皮間葉化生的循環腫瘤細胞。研究證實前列腺癌患者的轉移風險很大程度上可以由血清PSA水平結合外周血上皮間葉化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）的循環腫瘤細胞數來預測。EMT的特征有細胞黏附分子(如E-鈣黏蛋白、EpCAM)表達的減少、細胞骨架從細胞角蛋白（CK）為主轉化為波形蛋白（Vimentin）為主、N-鈣黏蛋白的表達上調以及形態上具備間充質細胞特征等[21,22]。通過EMT，上皮細胞失去了細胞極性，失去與基底膜的連接等上皮表型，獲得了較高的遷移與侵襲、抗凋亡和降解細胞外基質的能力，是上皮細胞來源的惡性腫瘤細胞獲得遷移侵襲能力以及耐藥的重要生物學機制[23,24]。Elzbieta Stankiewicz等通過原位雜交技術（m-fish）檢測前列腺癌患者外周血中具備EMT的循環腫瘤細胞，并結合血清PSA水平預測轉移風險，與單純運用血清PSA水平評估進行對比，研究結果顯示表達CK-/VIM+/CD45-的CTCs常與更高的腫瘤負荷、進展及不良預后相關；表達CK+/VIM+/CD45-的CTCs計數預測腫瘤轉移風險的可信度高于表達其他分子類型的循環腫瘤細胞，尤其是結合PSA水平進行綜合評估時(AUC 0.921，95%CI:0.858-0.985)[25]。

表皮生長因子受體（EGFR）是一種跨膜糖蛋白，具有絡氨酸激酶的活性，其與表皮生長因子（EGF）結合后，經過一系列信號轉導通路可啟動細胞核內有關基因的表達。其在惡性腫瘤細胞的增殖，遷移等過程中均發揮著重要的作用。研究發現癌癥患者腫瘤組織中往往存在EGFR的高表達，并且通常與疾病的進展及不良預后有關[26]。Takatsugu Okegawa等通過免疫熒光技術檢測CTC細胞表面EGFR的表達，在多西他賽化療前外周CTC計數≥5的CRPC患者中（n=37），有15例病人（40.5%）的CTC為EGFR表達陽性，通過與EGFR表達陰性的患者進行比較對照，發現陽性組的患者相比陰性組的患者具有更短的OS（5.5個月vs 20.0個月),且EGFR表達陽性的CTC或許是多西他賽化療后患者 OS更短的獨立預測因子（P＜0.01）[27]。

此外，研究也發現循環巨核細胞計數增多與晚期前列腺癌患者的生存率呈正相關 (HR 0.849,95%CI:0.628-1.146,per cell increase)，而間葉來源的CTCs與循環巨核細胞數量的差值與晚期前列腺癌患者的生存率呈負相關 (HR 10.17,95%CI:2.164-47.789,if score≥2.0)[25]，可以看到循環巨核細胞的檢測或許會為預測腫瘤進展及預后開辟新的道路，因此將循環巨核細胞與CTCs聯合進行檢測，是否能夠更為準確地預測前列腺癌患者的預后，這值得進一步去探討。

五、CTC中雄激素受體剪切變異體7基因的檢測在前列腺癌診療過程中的作用

近年來隨著精準醫學及分子醫學的發展,腫瘤細胞及CTC細胞內與癌變相關的基因檢測越來越得到重視，亦成為單純外周血CTC表面分子標記物（免疫學）檢測的有利補充。研究發現，去勢敏感性前列腺癌進展到CRPC涉及到AR軸的重新激活，這一過程涉及到CYP17的上調、AR基因的擴增、AR的剪接變異體的表達或者是AR受體本身的變異等[28]。睪酮合成的關鍵酶是細胞色素酶P450 17 A1（CYP17 A1），睪酮轉換為雙氫睪酮后和雄激素受體（androgen receptor,AR)結合而發揮效應。近年來，針對mCRPC出現了許多新的治療藥物，包括恩雜魯胺、阿比特龍、多西他賽、卡巴他賽、Sipuleucel-T及鐳-223等，這些藥物均能顯著改善患者的OS[29-33]，其中阿比特龍是CYP17 A1的抑制劑，而恩雜魯胺是雙氫睪酮的競爭性抑制劑。Antonarakis等利用 AlereTM CTC AdnaTest技術分離 CTC，并利用RT-PCR技術分析AR-V7基因的表達，在31例接受阿比特龍治療的mCRPC患者中，AR-V7陽性患者的PSA緩解率為0，而AR-V7陰性患者的PSA緩解率為68%(P=0.04)；AR-V7陽性患者的平均PSA無進展生存時間是1.3個月，而AR-V7陰性患者的平均PSA無進展生存時間是5.3個月（P＜0.01）。在31例接受恩雜魯胺治療的mCRPC患者中得到了類似的結果，因此AR-V7被認為可以用來預測mCRPC患者對新一代內分泌藥物如阿比特龍和恩雜魯胺的治療是否具有敏感性[34]。Seitz等將AR-V7水平及其他臨床變量（如是否進行阿比特龍及恩雜魯胺的預治療、ECOG評分，是否有內臟轉移等）與阿比特龍和恩雜魯胺治療后患者PSA應答（PSA下降≥50%）進行多變量回歸分析，發現只有AR-V7水平與PSA應答之間的關系有統計學意義，全血中高AR-V7水平是新型內分泌治療后PSA無應答的獨立預測因子（P=0.03）。AR-V7基因高表達與更短的PSA無進展生存時間（PSA-PFS）(中位2.4個月vs 3.7個月；P＜0.001),更短的臨床PFS(中位2.7個月vs 5.5個月；P＜0.001),更短的OS(中位4.0個月vs 13.9個月；P＜0.001)明顯相關。多變量回歸分析進一步顯示AR-V7高表達是更短的PSA無進展生存時間（HR 7.0,95%CI 2.3-20.7）、更短的臨床無進展生存時間（HR 2.3,95%CI 1.1-4.9；P=0.02）、更短的總生存時間 （HR 3.0,95%CI 1.4-6.3；P=0.005）的獨立預測因子[35]。

六、結論

綜上所述，外周CTC檢測在早期局限性前列腺癌患者中陽性率較低，這可能與目前CTC檢測技術的局限性有關。目前關于前列腺癌與CTC監測的研究主要集中在晚期前列腺癌，尤其是轉移性去勢抵抗性前列腺癌。CTC的監測在mCRPC中的應用得到了較多的證據支持，可用于預測CRPC患者的疾病進展、轉移風險、總生存期等。近年來隨著精準醫學的發展，對CRPC患者外周血CTC檢測已不僅僅局限于循環腫瘤細胞的表面抗原標記物，多項研究從CTC的基因及細胞內分子層面開展了對前列腺癌的研究，其中以雄激素受體剪切變異體7基因表達（AR-V7）最具代表性。AR-V7的表達檢測可以幫助判斷CRPC患者對新一代內分泌治療藥物如阿比特龍及恩雜魯胺治療是否具有敏感性，從而為精準治療提供幫助。作為比PSA更為敏感的預測因子，CTC檢測可以顯著縮短前列腺癌藥物臨床試驗的周期[36]，這在一定程度上可以減輕患者的痛苦及負擔。此外，也有學者提出殺死及清除前列腺癌患者循環中的CTC或許會成為一種全新高效的治療前列腺癌的手段[37,38]。

雖然CTC檢測在前列腺癌特別是去勢抵抗性及晚期轉移性患者中具有很好的應用前景，但目前已進行的研究仍受限于檢測技術，并且存在臨床研究規模不大及研究質量不足的問題。相信隨著科學家的努力和CTC檢測技術的進步，CTC將逐步擴展應用于早期局限型、局限進展型以及轉移性激素敏感型前列腺癌的診斷治療過程中，從而為患者帶來福音。