國外醫學研究新進展（五）

楊柳

1 BRAF失活突變誘導肺癌發生

近乎一半的人類肺腺癌致癌的發病機制尚未明確，這常常會使選擇性靶向藥物的開發變得復雜化。然而這些腫瘤中可檢測到許多沒有明顯致癌功能的突變，包括BRAF的失活性突變。在肺癌中BRAF（V600E）失活突變的頻率遠超其他癌癥。我們通過研究發現，小鼠機體中內源性BRAF（D631A）激酶失活亞型的表達[相當于人類（D594A）突變]會在體內誘發肺腺癌的發生。這就表明，BRAF失活性突變或會誘發肺腺癌事件的發生。利用公共數據庫進行研究，我們在一系列KRAS驅動的人類肺部腫瘤中鑒別出了失活的BRAF突變。隨后我們利用小鼠模型進行研究，對相關研究結果進行了再現，結果表明，致癌Kras（G12V）和失活BRAF（D631A）的共表達或許會增加肺腺癌的發生率。我們還發現了野生型BRAF在維持Kras（G12V）/BRAF（D631A）驅動的腫瘤中的關鍵作用。野生型BRAF等位基因的缺失使致癌毒性的MAPK信號通路進一步增強，從而阻止肺腺癌的發展；Mek可抑制這一現象并恢復腫瘤的生長。然而，野生型BRAF的喪失也會引起棒狀細胞的轉分化，這導致致死性腦內神經根病變的快速發展。這些觀察結果表明，MAPK通路的信號強度不僅是腫瘤發展中的關鍵因素，也是決定癌癥起始細胞的性質以及最終表型的關鍵因素。[Chen W,Zheng R,Baade PD,et al.Cancer statistics in China,2015 [J].CA Cancer J Clin,2016,66(2):115-132.doi:10.1038/nature23297.]

2 轉移癌的整合臨床基因組學

轉移癌是導致患者死亡的主要原因。雖然我們已經獲得原發性腫瘤的癌癥基因組測序圖譜，但對轉移癌的綜合分子分析仍不清楚。我們納入500例不同家族的成年患者，對其轉移性實體瘤進行全外顯子和轉錄組測序。轉移性癌中最常見的基因突變包括TP53、CDKN2A、PTEN、PIK3CA和RB1。在12.2%的病例中存在推測的遺傳變異，其中75%與DNA修復缺陷有關。RNA測序補充了DNA測序結果并明確基因融合、通路激活和免疫的變化。我們的研究結果表明，綜合測序分析為復雜的基因圖譜和轉移性癌的微環境提供了多維的觀察結果。[Robinson DR,Wu YM,Lonigro RJ,et al.Integrative clinical genomics of metastatic cancer [J].Nature,2017,548 (7667):297-303.doi:10.1038/nature23306.]

3 MACC1和基因錯配修復對Ⅱ期結腸癌患者復發風險的預測價值

目的：基因MACC1可根據錯配修復（pMMR）情況將Ⅱ期結腸癌患者進行預后分組。

方法：本研究納入596例患者，其中Charité 1隊列檢測凍存結腸癌腫瘤標本中MACC1 mRNA表達水平和MMR，Charité 2隊列對FFPE樣本進行MACC1 qRT-PCR分析。BIOGRID 1隊列研究發現MACC1 mRNA表達水平與FFPE切片免疫組化中MACC1的蛋白水平相關。根據MACC1 mRNA和蛋白水平對化療前pMMR患者進行風險分組并用無復發生存期（RFS）評估其準確性。BIOGRID 2隊列證實BIOGRID 1的風險分組的正確性。綜合BIOGRID數據后我們明確了最佳效應量的估計值。

結果：BIOGRID 1隊列中qRT-PCR和免疫組化檢測結果表明低pMMR/MACC1患者（5年RFS，92%/67%）比高pMMR/MACC1患者復發概率低（5年RFS，100%/68%）。BIOGRID2對列研究發現低pMMR/MACC1患者的RFS比高pMMR/MACC1患者長（5年RFS分別為100%和90%）。在綜合數據集中，低pMMR/MACC1患者中6.5%無復發，導致其5年RFS（95%CI：12.6%～21.3%）比高pMMR/MACC1患者高出17%（P=0.037）。低pMMR/MACC1和MMR缺陷（dMMR）患者的預后相似（5年RFS分別為100%和96%）。

結論：MACC1表達水平的差異可預測pMMR的結腸癌患者的預后。低pMMR/MACC1的Ⅱ期結腸癌患者和dMMR患者都有良好的預后，這將影響臨床醫生對輔助治療的選擇。[Rohr UP,Herrmann P,Ilm K,et al.Prognostic value of MACC1 and proficient mismatch repair status for recurrence risk prediction in stageⅡcolon cancer patients:the BIOGRID studies[J].Ann Oncol,2017,28(8):1869-1875.doi:10.1093/annonc/mdx207.]

4 人類癌癥轉錄組病理圖譜

癌癥是人類死亡的主要原因之一，因此了解個體腫瘤發生、發展的潛在分子機制是十分必要的。我們分析了17種不同癌癥中蛋白質編碼基因轉錄組與其臨床預后的關系。結果發現細胞增殖基因上調/分化基因下調與患者生存期縮短有關。全基因組代謝模型分析發現癌癥患者具有廣泛的代謝異質性，因此癌癥患者需要更精確和個體化的治療。所有數據都可在數據庫（www.proteinatlas.org/pathology）中下載，以便全面探索蛋白質對臨床預后的影響。[Uhlen M,Zhang C,Lee S,et al.A pathology atlas of the human cancer transcriptome[J].Science,2017,357(6352).doi:10.1126/science.aan2507.]

5 異常生長修復可維持組織動態平衡

健康組織中的細胞以驚人的頻率獲得突變。許多突變與細胞的異常行為有關，例如細胞分化缺陷和過度增殖，但未產生宏觀可檢測的表型。盡管組織中存在突變細胞，目前研究者尚不清楚其如何保持表型正常。我們使用活體成像技術追蹤小鼠上皮細胞的變化--其上皮內存在大量活化的Wnt/β-catenin干細胞。我們發現所有被破壞的皮膚組織結構都會恢復，無論其面積大小。野生型細胞是消除組織中突變細胞所必需的，其可同時利用內源和異位細胞的行為來消除異常結構。組織結構恢復后，剩余的結構要么完全消除要么轉化為功能性皮膚附屬物。此外，野生型細胞還可校正致癌基因Hras導致的組織異常，甚至是與突變無關的組織變形。這些耐受現象反映了皮膚的保守原則。這項研究揭示了當面臨突變或非突變性損害時成人皮膚上皮意想不到的可塑性，并闡明了維持組織穩態時細胞的動態行為。[Brown S,Pineda CM,Xin T,et al.Correction of aberrant growth preserves tissue homeostasis [J].Nature,2017,548(7667):334-337.doi:10.1038/nature23304.]

6 早期胰腺癌腫瘤特異性DNA與蛋白質生物標志物的聯合檢測方法

癌癥的早期診斷是降低其病死率的關鍵環節之一。我們致力于研發可應用于胰腺導管腺癌早期診斷的非侵入性血液檢測技術。本文的研究目的在于比較血液KRAS基因突變聯合蛋白質生物標志物的檢出率是否優于任意單個標志物的檢出率。實驗包括221例可切除胰腺導管腺癌患者和182例健康對照者。我們在66例患者（30%）的血漿中檢測到KRAS突變，并且每例患者血漿中發現的突變與隨后原發腫瘤樣本中發現的突變相同（100%一致性）。KRAS與四種蛋白生物標志物的聯合檢測使其靈敏度提高到64%。對照組中只有1例任何DNA或蛋白質生物標志物都是陽性的人（99.5%的特異性）。這種聯合檢測的方法可檢測出多種早期癌癥。[Cohen JD,Javed AA,Thoburn C,et al.Combined circulating tumor DNA and protein biomarker-based liquid biopsy for the earlier detection of pancreatic cancers[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2017,114(38):10202-10207.doi:10.1073/pnas.1704961114.]

7 皮膚癌的紅色警報——脂質

紅色的頭發在多種文化中都是魅力的象征，同時也越來越受到科學家的關注。對小鼠模型和人類細胞的研究發現皮膚癌發生的風險與某些蛋白質相關，而這些蛋白質與紅發有關。

皮膚黑色素細胞和頭發毛囊產生的黑色素可引起致命的黑色素癌。紫外線可導致DNA損傷并產生有害的突變，而黑色素可保護皮膚免受陽光的紫外線輻射。MC1R蛋白調節黑色素細胞分泌黑色素。黑色素細胞受MC1R蛋白刺激時產生真黑色素，但在MC1R信號低或缺如的情況下，主要產生一種紅色或橙色的海馬素。幾乎所有紅發個體都存在MC1R表達減少或缺乏的現象，因此大多數紅發個體的皮膚白皙且不易曬黑。

MC1R基因能性突變可導致小鼠出現黃色皮膚，因此MC1R基因最先在小鼠中發現。許多其他物種也有與MC1R基因相關的色素變化，如紅色或黃色毛發的狗。古歐洲血統的人類通常攜帶MC1R基因突變，他們紅發顏色的深淺也與突變有關：一些突變總是導致紅發，而另一些則不。MC1R突變是出現紅發的必要不充分條件，這表明大多數突變是無功能突變，紅發的出現還取決于其他遺傳基因或細胞因子。

陳教授團隊嘗試在人黑色素瘤細胞中確定增強MC1R下游信號轉導的紅發相關蛋白。他們發現脂肪酸分子棕櫚酸酯符合這個標準。在棕櫚?；倪^程中，棕櫚酸酯與蛋白質相連，使蛋白質疏水性增加，與細胞膜之間的相互作用隨之增強。這種變化使MC1R靶向細胞膜的難度和時間增加，從而調節受體的活性。

MC1R屬于G蛋白偶聯受體家族，其細胞信號通路機制與G蛋白受體家族相同。已知許多G蛋白受體可棕櫚?；?。雖然之前的研究未發現MC1R可被棕櫚酰化，但它附近氨基酸基團羧基末端是特征性的棕櫚?；稽c。有證據表明紅色和黃色皮膚的小狗MC1R蛋白上的棕櫚?；稽c突變，表明該位點是MC1R蛋白重要的功能位點。

陳教授團隊證明體外培養的人類細胞中MC1R蛋白可被棕櫚酰化。他們發現UV暴露后細胞棕櫚?；磻黾?，并且周圍的角化細胞會分泌短肽激素α-MSH刺激受體。MC1R棕櫚?；皆黾訉е铝薓C1R介導的黑色素分泌信號傳導和激活隨之增加。MC1R突變可導致蛋白無法棕櫚酰化，無論有無UV刺激都無法激活信號通路。

棕櫚?；勺貦磅＾D移酶家族（ZDHHC）介導的。陳教授測試了ZDHHC家族調節MC1R的能力，認為ZDHHC13是調節MC1R棕櫚?；闹饕?。UV暴露后，細胞中MC1R棕櫚?；胶褪荏w信號傳導水平隨ZDHHC13的變化而變化。此外，紫外線暴露誘導的DNA損傷可激活ATR酶，使ZDHHC13磷酸化。ZDHHC13的磷酸化導致ZDHHC13和MC1R之間的相互作用增加。這表明紫外線損傷DNA可反過來增強MC1R信號從而刺激DNA修復。然而，上述理論存在一個問題。zdhhc13突變的小鼠似乎沒有表現出MC1R缺陷，盡管小鼠毛發生長困難，但其顏色不受突變的影響。也許在體內存在另一個可調節MC1R的ZDHHC家族酶，或者ZDHHC13對DNA損傷的反應非常有限。陳教授團隊采用黑色素細胞中含BRAF基因突變的小鼠研究MC1R棕櫚?；脑鰪娛欠駮绊懞谒亓龅男纬伞＝Y果表明不管是MC1R缺陷的小鼠還是攜帶常見的MC1R突變的紅發人群在UV暴露后比BRAF突變的小鼠更易產生腫瘤。但是如果在紫外線照射之前，給予MC1R突變小鼠增加棕櫚酰化作用的小分子，其腫瘤產生慢于對照組小鼠。

研究發現小鼠皮膚黑色素細胞對紫外線的反應可由相鄰的角質形成細胞介導。DNA損傷后角質細胞會產生蛋白質p53。反過來，誘導合成α-MSH，隨后活化黑色素細胞中MC1R。MC1R突變對UV暴露后產生的DNA損害的影響是多方面的。首先，MC1R突變細胞中α-MSH活性降低，導致黑皮素產生減少，因此不能保護皮膚免受進一步紫外線損傷。第二，MC1R突變后不能刺激黑色素細胞修復DNA，使基因組免受致癌突變的影響。最后，MC1R突變產生更多致癌的黑色素，促進黑色素瘤形成。

MC1R是黑色素瘤的抑癌基因。無論是在野生型或部分功能喪失的突變細胞中，MC1R棕櫚酰化水平的增加都可增強其功能。因此增加MC1R棕櫚?；绞羌t發人群預防黑色素瘤的一個有效的臨床方法。涂抹防曬霜、減少陽光照射是預防皮膚癌的有效措施。但事實上，攜帶MC1R突變的個體即使紫外線暴露量被控制，其患黑色素瘤的風險仍高于正常人。另一種方法是使用藥物增強MC1R下游信號通路，但這會激活黑色素細胞的保護變黑反應。這種影響可能是獲得性MC1R突變人群所特有的。前學者報道一些MC1R紅發突變個體的信號傳導能力下降，因為MC1R不能正確結合在細胞膜上。

從醫學角度來看，干預治療健康個人的常見遺傳變異不可取。此外，非紅發人群攜帶單拷貝的突變MC1R基因也有發生黑色素瘤的風險。攜帶MC1R變異基因的人數超過北歐人口的一半。對這種人口級別的預防性治療似乎不太可能。但是刺激紫外線損傷后的黑色素細胞中DNA修復是預防黑色素瘤發作的重要理論，特別是在缺乏MC1R的人群中。

有趣的是，許多天然產物含有棕櫚酸酯。蓮花油中的棕櫚酸酯可使黑色素細胞的黑色素生成增強。椰子油也含有豐富的棕櫚酸鹽，但是傳聞椰子油可以美黑？[Jackson IJ,Patton EE.Cell signalling:Red alert about lipid's role in skin cancer[J].Nature,2017,549(7672):337-339.doi:10.1038/nature23550.]

8 棕櫚酰依賴性MC1R可預防黑色素瘤的發生

黑皮質素-1受體（MC1R）是一種G蛋白偶聯受體，在人和小鼠色素沉著中起重要作用。通過α-黑素細胞刺激激素（α-MSH）激活黑色素細胞中的MC1R，MC1R隨之刺激cAMP信號和黑色素生成，并增強紫外線暴露后DNA修復能力。攜帶MC1R突變的個體通常皮膚白皙不易曬黑，并且得黑色素瘤的風險較高，特別是紅發的個體（RHC突變）。然而，紫外線暴露如何調節MC1R活性，紅發人群為何更容易出現黑色素瘤以及RHC突變是否可以通過治療恢復都是未知的。此次研究我們闡述一種潛在的MC1R靶向干預策略，通過激活MC1R蛋白棕櫚?；瘉碇委烳C1R RHC突變中功能喪失的MC1R。MC1R棕櫚酰化主要由蛋白質-酰基轉移酶ZDHHC13介導。MC1R棕櫚酰化對激活MC1R信號通路是必需的，可引起色素沉著、G1期細胞周期停滯以及控制衰老與黑色素瘤的產生。我們采用內源性MC1R缺陷的C57BL/6J-Mc1re/eJ小鼠表達Mc1r RHC突變，棕櫚?；赏炀萂c1r RHC突變的缺陷并防止黑色素瘤形成。結果表明MC1R棕櫚?；谏爻林皖A防黑色素瘤中的重要作用。[Shuyang Chen,Bo Zhu,Chengqian Yin,et al.Palmitoylation-dependent activation of MC1R prevents melanomagenesis[J].Nature,2017，549(7672):399-403.DOI:10.1038/nature23887.]

9 腸癌患者糞便促使無菌小鼠致癌

目的：腸道微生物可導致結腸直腸癌（CRC）發生。一些腸道細菌可產生基因毒素，進而改變免疫應答、腸微環境并激活致癌信號通路來促進腸癌的發生。此研究目的在于明確CRC患者的糞便是否可以直接誘導小鼠結直腸癌的發生。

方法：糞便樣本來源于香港宏基因組研究項目的參與者。我們首先用氧化偶氮甲烷（AOM）和抗生素來誘導小鼠產生結直腸腫瘤。隨后，我們分別給小鼠移植了結直腸癌患者和健康人的糞便。糞便樣本分別來自5個結直腸癌患者和5個健康人。最后我們收集小鼠腸道組織，進行組織學、免疫組化、表達譜、定量PCR、免疫印跡和流式細胞術分析。我們對小鼠糞便進行了16S rRNA基因測序分析。

結果：與對照組比較，CRC患者糞便灌胃的小鼠出現高級別發育不良（P＜0.05）和肉眼可見息肉（P＜0.01）的比例明顯升高。此CRC患者糞便灌胃的無菌小鼠的結腸增殖（Ki-67陽性）細胞的比例比對照組更高（P＜0.05）。CRC患者糞便灌胃的小鼠和對照組小鼠的糞便由不同的微生物組成，CRC患者糞便灌胃的小鼠糞便生物豐富度較低。CRC患者糞便灌胃的正常小鼠和無菌小鼠的腸道中炎癥細胞因子的表達增加，包括CXCR1、CXCR2、IL17A、IL22和IL23A。CRC 患者糞便灌胃的正常小鼠和無菌小鼠腸道中含有較高比例的Th1細胞（2.25%vs 0.44%）和Th17細胞（2.08%vs 0.31%）（P＜0.05）。RT-PCR發現CRC患者糞便灌胃的小鼠腸道細胞增殖、干性、凋亡、血管發生、侵襲和轉移的基因上調。

結論：我們采用CRC患者和健康個體的糞便樣本灌胃飼養無菌小鼠和含有氧化甲烷的正常小鼠。與對照組相比，我們發現CRC患者糞便灌胃的小鼠結腸中的糞便數量、腸道發育不良程度、增殖水平、炎癥標志物以及Th1和Th17細胞的比例增加。這項研究表明CRC患者糞便中的微生物群可以促進小鼠腸道腫瘤的發生。[Wong SH,Zhao L,Zhang X,et al.Gavage of Fecal Samples From Patients With Colorectal Cancer Promotes Intestinal Carcinogenesis in Germ-Free and Conventional Mice[J].Gastroenterology,2017,153(6):1621-1633.doi:10.1053/j.gastro.2017.08.022.]

10 KLF6表達抑制可激活E2F1并促進腎透明細胞癌的轉移

轉錄因子KLF6在多種癌癥的發生和轉移中具有重要作用。在原發性轉移性腎透明細胞癌（ccRCC）中KLF6的表達降低，然而KLF6表達降低后如何影響惡性腫瘤進展的機制仍不清楚。此次研究中我們證明腎透明細胞癌KLF6表達的降低可促進E2F1介導的EMT和轉移能力。人ccRCC小鼠異種移植模型實驗證明沉默KLF6可加強腫瘤細胞的增殖和惡性程度，而沉默E2F1的結果完全相反。癌癥轉移模型動物證實沉默KLF6同時增加E2F1表達導致大量的肺轉移病灶產生。針對ccRCC臨床標本的分析發現低水平KLF6和高水平E2F1表達與ccRCC發生密切相關?？傊?，我們的研究結果明確了KLF6-E2F1軸激活在ccRCC中的意義，闡明了導致人類ccRCC侵襲和轉移的關鍵機制。[Gao Y,Li H,Ma X,et al.KLF6 Suppresses Metastasis of Clear Cell Renal Cell Carcinoma via Transcriptional Repression of E2F1[J].Cancer Res,2017,77(2):330-342.doi:10.1158/0008-5472.]

11 人類癌癥中高頻突變的綜合分析

研究納入＞81 000個兒科和成人腫瘤患者（包括由化療、致癌物或遺傳改變引起的高頻突變腫瘤）的測序分析數據，對其突變負荷進行評估。在既往研究未發現大量突變的腫瘤類型中，我們也檢測到了高頻突變。DNA修復的缺陷是高頻突變的主要原因。我們在DNA修復相關的DNA聚合酶、微衛星不穩定性和修復缺陷中發現了新的驅動基因突變?；谕蛔儽尘跋碌呐R床亞組分析表明不同起源的腫瘤具有相似的向高頻突變發展的特性。一些致癌因素可導致意想不到的癌癥，包括肉瘤和肺腫瘤。癌癥前期治療及DNA修復缺陷的突變特征的檢出可改善患者和家屬的管理，且這些數據可用于腫瘤分類、基因檢測和臨床試驗設計。[Campbell BB,Light N,Fabrizio D,et al.Comprehensive Analysis of Hypermutation in Human Cancer[J].Cell,2017,171(5):1042-1056.doi:10.1016/j.cell.2017.09.048.]

12 循環腫瘤DNA對早期癌癥的診斷作用

癌癥的早期診斷和干預治療是降低人類癌癥發病率和病死率的最有效手段。然而，無創性的早期腫瘤檢測方法的開發仍然是一個挑戰。我們開發了一種靶向誤差校正測序（TEC-Seq）技術，該技術可在大規模并行測序中對循環游離DNA的序列變化進行超靈敏的評估。我們使用這種方法檢查58個癌癥相關基因。來自44個健康個體的血漿分析發現16%的無癥狀個體出現與克隆性造血有關的基因組變化，但與實體癌相關的驅動基因沒有改變。對200例結直腸癌、乳腺癌、肺癌或卵巢癌患者的評估發現，分別有715 959和68%的Ⅰ或Ⅱ期患者血漿中出現體細胞突變。血液循環中的突變分析結果與這些患者的腫瘤改變高度一致。在可切除的結腸直腸癌患者中，含量較高的術前循環腫瘤DNA與疾病復發和總體生存率降低有關。這些分析為早期腫瘤的無創檢測提供了可用于癌癥患者的篩查和管理的方法。[Phallen J,Sausen M,Adleff V,et al.Direct detection of early-stagecancersusingcirculatingtumorDNA[J].SciTransl Med,2017,9(403).doi:10.1126/scitranslmed.aan2415.]