自噬及其在缺血性腦中風中雙重作用的研究進展

正常細胞受饑餓、衰老和蛋白錯誤折疊或聚集等因素的誘發，為應對胞內外環境應激變化，維持自身穩定，細胞發生自噬現象[1]。然而，當自噬(autophagy)的水平超過細胞所能承受的限度，則會引起細胞過度損傷甚至死亡。通常，陳舊蛋白及受損細胞器主要通過自噬降解，而短時作用蛋白則通過泛素-蛋白酶體途徑降解，二者共同維持細胞存活[2]。隨著對細胞自噬認知的不斷提高，自噬的生物學作用與損傷神經元功能修復方面的聯系逐漸顯現出來，自噬與腦中風的康復治療隨即受到基礎或臨床醫學的普遍關注。

腦中風是一種由腦組織缺血及出血導致的以神經功能缺陷為主要臨床表現的急性腦血管病。該疾病具有三大特征：發病率高、致殘率高和死亡率高。據數據統計表明，我國每年有約800萬腦中風新發病人，年死亡人數超過200萬，且年增長速率高達8.7%，其中約70%的病人因為腦中風造成神經功能嚴重缺陷不能獨立生活，嚴重影響病人生活質量，加重家庭和社會負擔[3]。在腦中風病人中，約80%為缺血性腦中風，又稱缺血性腦損傷。當前僅有纖維組織酶原激活劑(tissue plasmagrn activator，tPA)為有效的治療藥物，但僅3 h的給藥時間窗及嚴重的副作用如出血等，極大地限制了tPA的廣泛應用[4]。此外很多在動物實驗中找到的神經保護藥物在臨床上均未獲得理想的效果，顯示出嚴重的毒副作用。最近研究顯示，自噬是一種可逆性的細胞死亡，通過針對自噬的藥物治療可明顯提高腦中風梗死半影區的細胞存活，并可顯著改善腦中風后的神經功能恢復。因此深入探究自噬對缺血半影區損傷神經元的修復作用及其調控機制，進而尋求有效的神經保護方案顯得尤為重要。本文重點討論自噬對神經元存活的影響，以及自噬在腦中風后的神經保護及神經損傷作用。并討論干預自噬提高腦中風后神經保護的可能機制，為研究自噬在腦中風后的病理及藥理機制提供參考。

1 自 噬

自噬即指細胞的自我吞噬，是細胞應對內外界環境應激變化而引發的一種適應性反應。在不同的條件下，自噬可發揮不同的效應。一方面，細胞通過自噬降解細胞陳舊蛋白質、損傷細胞器等實現自我更新，同時釋放氨基酸和三磷酸腺苷(ATP)等緩解組織內的能量供應短缺，提高損傷細胞的存活率。另一方面，當自噬過度激活或自噬不足時，則引發自噬應激，破壞細胞穩態，擾亂細胞的正常代謝，導致細胞器損傷，如觸發線粒體死亡途徑等，引起自噬性細胞死亡，即Ⅱ型程序型細胞死亡(programmed cell death，PCD)，對細胞有害，并參與多種疾病的致病過程[5]，與另一種Ⅰ型程序性細胞死亡有所區別，所以說自噬在疾病中有雙重作用。

1.1 自噬的分類 按照生理功能和細胞內底物運送至溶酶體內被降解方式的差異，可將自噬分為巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侶介導的自噬(chaperon-mediated autophagy，CMA)。巨自噬是指雙層膜結構自噬體(autophagosome)先包裹細胞需要降解的廢棄物，并通過與溶酶體結合形成自噬溶酶體(autolysosome)，而后溶酶體酶使物質循環再利用。在生理狀態下，巨自噬已被證明在中樞神經系統(central nervous system，CNS)中具有保護作用，是通常所指的自噬過程。微自噬是指溶酶體本身膜形變為溶酶體內膜泡，直接吞噬胞質、內含物和細胞器的方法。CMA是指胞質內蛋白最初與分子伴侶如熱休克蛋白70(hot shock protein，HSP70)結合后被轉運到溶酶體腔中，繼而被溶酶體酶消化。雖然這3種主要方式發生過程不同，但在維持細胞內環境穩態方面具有共同的作用。

1.2 自噬的發生周期 具體來說自噬的產生周期可人為地將其分為自噬膜的誘導、自噬體的形成、自噬體的運輸、自噬體的降解4個階段，是一個高度調控的多步驟進程，其中最為關鍵是自噬體的形成。①自噬膜的誘導：在饑餓、缺血缺氧和生長因子缺乏等上游信號的刺激下，自噬前體由粗面內質網和高爾基體參與包裹降解物而形成。通過識別機制的不同將這一階段分為有選擇性和非選擇性兩種自噬，前者由細胞內的底物誘導發生，而后者由細胞外的刺激發生。②自噬體的形成：分隔膜經過延伸和彎曲構成 “C”形至“O”形的雙層膜結構自噬體，其直徑一般在500 nm左右，此過程受微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain 3，MAP1-LC3)和自噬相關基因5-12兩種泛素樣結合系統的調控。③自噬體的運輸：自噬體通過自身的運輸與溶酶體結合形成單層膜結構的自噬溶酶體。④自噬體的降解：通過溶酶體中的酶消化分解，使自噬體膜分離，并且將有用的產物如氨基酸、核苷酸等輸送到胞漿中循環利用。

2 自噬對神經細胞的作用效應

細胞自噬不同于壞死和凋亡，它可以讓細胞獲得再生的機會。由于大部分神經細胞不能分裂，對于神經元這類不可再生的細胞來說，這個過程尤為重要，多數細胞器的更新依賴于自噬機制。分化完全的神經細胞，想要通過其他方式來恢復自身功能幾乎是不可能的，倘若自噬相關基因發生突變則細胞必將受損直至死亡。例如將小鼠的自噬相關基因Atg5敲除，可導致大量蛋白聚集在神經元，自噬功能異常，出生后的幾小時內小鼠便死亡[6]。此外，神經細胞自噬不僅實現自我消化，而且也為周圍細胞提供原料，使細胞對抗外界不利因素的適應能力大大提高。研究表明，自噬功能缺失與缺血性疾病、神經退行性疾病、腫瘤、炎癥和免疫性疾病密切相關。

3 缺血性腦中風后自噬研究的基本方法

3.1 自噬的檢測 累積的證據表明，缺血性刺激后，自噬在腦組織或神經細胞中被激活。主要通過電子顯微鏡觀察法、免疫印跡、免疫組化、免疫熒光檢測，從形態學和生物化學等方面提供單個或組合的實驗證據。

自噬的檢測方法分為直接法和間接法兩種形式，前者在于觀察自噬的形態，后者則是檢測自噬表達的特征蛋白。1995年，Nikoletopoulou等首次通過電子顯微鏡觀察到雙側頸總動脈結扎的沙土鼠大腦海馬CA1區的自噬現象[7]。直到現在，準確地對自噬體進行定位、定性甚至定量檢測，一直是檢測自噬的金指標。MAP1-LC3 是酵母菌自噬基因(Atg7/Atg8)在哺乳動物中的同源物，作為自噬體形成的標志性蛋白，其在組織中以胞漿型(LC3-Ⅰ)和膜型(LC3-Ⅱ)兩種形式存在，因此，想要觀察自噬水平的增強和減弱可采用Western Blot 技術分析LC3-Ⅱ/Ⅰ的灰度值[8]。Beclin1 是另一種檢測自噬的起始標志物，這種自噬相關蛋白與酵母中Atg6同源。不同的是P62蛋白在自噬過程作為負調節因子，也都在研究缺血性腦中風中作為自噬的常用指標。除此之外，還有單丹(磺)酰戊二胺(monodansylcadaverin，MDC)染色法、吖啶橙(acridineorange，AO)染色法和熒光顯微鏡法，是基于自噬原理的特殊染色方法。

3.2 自噬的調控 細胞在正常情況下，自噬的表達水平較低，然而當神經元受到過多的外界刺激，就使得基礎自噬轉變為誘導自噬[9]。而在缺血性腦卒中的研究中自噬的誘導常常需要加入自噬的抑制劑和激活劑作為實驗的對比驗證。

主要影響自噬的調控機制大致分為磷酸肌醇三磷酸激酶(PI3K)、雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin，TOR)、GAI3 蛋白和氨基酸、激素等[10]。這其中Ⅰ型PI3K和哺乳動物TOR(mTOR)作為抑制自噬信號的通路，而PI3K通路的Ⅲ型則作為激活自噬信號的通路。3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)、渥漫青霉素(Wortmannin，WM)和LY294002是研究者普遍使用的自噬抑制劑，它們都可以阻止或影響自噬體的形成，這其中最為理想的抑制效果是3-甲基腺嘌呤，作為Ⅲ型PI3K通路的抑制劑。值得關注的是，有研究表明，3-MA對自噬具有雙重作用，在營養充足下，3-MA能促進自噬的發生，而在細胞饑餓條件下抑制自噬的發生[11]。巴伐洛霉素A1(Bafilomycin A1)和長春堿用于阻斷自噬體與溶酶體的融合，E64d作為蛋白酶抑制劑則參與抑制溶酶體的降解。雷帕霉素(rapamycin，RAP)是mTOR的抑制劑，有助于Atg13的去磷酸化和其他自噬相關基因的活化，促進自噬的發生，是一種廣泛應用的自噬激活劑[12]。

4 自噬與缺血性腦中風

在大量缺血性腦中風動物模型中發現，腦缺血可顯著激活細胞的自噬活性，并可通過藥物干預調節。由于自噬在缺血性腦中風后受細胞損傷的嚴重程度、缺血時間長短和缺血腦區部位等多種因素的影響，自噬在腦中風后的作用效應不盡相同，甚至截然相反。通過檢索新近文獻，自噬在腦中風后的作用歸納如下。

4.1自噬在缺血性腦中風的保護作用 在腦缺血發生的早期，為應對神經元的損傷，自噬體運載其內容物從軸突運輸至胞體，與溶酶體融合后，清除受損神經細胞，保護周圍的神經細胞，維持神經系統內環境的穩態，自噬被稱為神經元的“管家”，輕度或中度激活自噬可提高神經細胞生存[13]。Jiang等[14]在大鼠永久性缺血前進行缺血預處理，當加入用載體化合物C(AMPK抑制劑)或自噬抑制劑3-MA后，腦梗死體積增加，神經損傷嚴重，表明提高自噬有助于缺血性腦中風的神經保護。Zhou等[15]分別建立了大鼠局灶性腦缺血體內動物模型和氧糖剝奪(OGD)體外細胞模型。通過腹腔注射自噬誘導劑雷帕霉素增強自噬，結果顯示，腦梗死體積、腦組織中丙二醛、過氧化物歧化酶和細胞色素C水平顯著下降。相反，海馬神經元OGD 模型用3-MA 抑制自噬后，原代海馬神經元損傷明顯加重。由此推測，自噬對缺血性腦中風具有神經保護作用。Wei等[16]建立小鼠大腦中動脈誘導的缺血性腦中風實驗說明，神經元特異性常規蛋白激酶C(cPKC)γ通過Akt-mTOR途徑調節自噬的升高，改善了缺血性腦卒中后小鼠的神經學結果。Yan 等[17]實驗得出高壓氧預適應與自噬激動劑雷帕霉素具有相似的功能， LC3-Ⅱ以及Beclin1 的自噬蛋白表達升高后腦損傷減少，3-甲基腺嘌呤抑制自噬后，腦損傷則加劇。值得關注的是，另有研究發現，雷帕霉素在腦缺血的初期保護作用顯著，但在腦缺血末期其保護效果顯著降低[18]。

4.2 自噬在缺血性腦中風的損傷作用 但也有研究者提出相反的結論，在營養匱乏、毒性刺激和低氧等應激因素的刺激下，細胞的自噬活性明顯增強，當超過細胞所能承受的范圍時，眾多的自噬底物在軸突中積聚，迫使溶酶體逆向轉運至軸突，從而使軸突運輸功能紊亂，最后導致神經元受損，因此過度的激活自噬促進神經細胞大量死亡[9]。Dong等[19]用Nissl染色顯示，接受Ro25-6981治療的大鼠海馬CA1錐體層神經元損傷減少，降低雷帕霉素誘導的神經元損傷和缺血再灌注后自噬的過度激活，對神經元有保護作用。Wang等[20]研究建立了大鼠遠端缺血期處理和缺血后處理結合模型，通過抑制自噬減弱了血漿HMGB1水平，腦缺血再灌注損傷的神經保護作用明顯，而加入自噬激活劑雷帕霉素損傷增強。Yang等[21]通過永久性大腦中動脈閉塞(pMCAO)在小鼠中構建了局灶性腦缺血模型，檢測到體內小膠質細胞的自體吞噬和炎癥反應，使用藥物抑制劑3-MA抑制自噬不僅降低了小膠質細胞的自噬和炎癥反應，而且降低了腦梗死面積，減少了水腫形成和神經缺陷，表明腦缺血誘導的小膠質細胞自噬增強缺血性神經炎癥和損傷。Luo等[22]用右旋美托咪啶(dexmedetomidine，DEX)和3-MA后處理對于用雷帕霉素處理的短暫動脈閉塞(tMCAO)模型相比較，抑制缺血周圍腦組織的神經元自噬可以減少腦梗死面積并改善神經功能缺陷，增加氧糖剝奪模型中原代培養神經元的活力和凋亡，這表明在再灌注開始時抑制神經元自噬，可以保護小鼠腦免受缺血再灌注損傷，有助于提高受損神經元的存活。

4.3 自噬和缺血性腦中風相關研究的總結分析 越來越多的研究證實，自噬在缺血性腦中風后的作用十分顯著。而在腦缺血前進行缺血預適應可挽救自噬造成的腦缺血損傷，其與缺血性腦卒中自噬發生的時間及程度有所區別。盡管目前關于腦缺血后自噬對神經元是保護還是損傷仍然眾說紛紜，其可能存在的機制包括：以降解神經突觸為神經元提供能量；降解受損的線粒體從而抑制凋亡發生；降解能量消耗來緩解細胞死亡[23]。但可以確定的是在腦缺血的初期，自噬的激活是對外界環境變化的一種適應性反應，并作為一種防御機制；而隨著自噬的增加，如在腦缺血的末期，神經元損傷則以凋亡和壞死為主，原因在于自噬的保護作用及損傷作用在不同條件下可能會相互轉化。使用化學藥劑對自噬的非特異性和單一方法監測動物腦缺血模型自噬的可靠性等都會造成實驗結果的不一致，使得必須避免動物模型個體差異的影響，設計多個監測時間點[24]。 Sadoshima 等[25]歸納總結：適度自噬可可提高缺血性腦中風后的神經保護作用，而過度自噬加劇缺血性腦中風的神經損傷。

5 展 望

自噬參與多種生理和病理過程。雖然自噬在缺血性腦中風的確切作用還存在爭議，但可以確定的是，自噬可調節腦缺血半影區損傷神經元死亡和存活之間的平衡，在損傷神經元的命運轉歸中發揮關鍵作用。但清楚認識自噬發生的相關調節因素及信號通路，腦缺血時自噬與凋亡、壞死之間的轉換關系及作用，以及藥物對腦缺血的有效治療方法還有待進一步研究，更加深入全面地認識自噬與缺血性腦中風的關系，以及相關的病理及藥理機制，為腦中風的臨床治療提供重要的研究基礎及可行性線索。