超聲靶向破壞微泡技術在糖尿病腎病基因治療中的應用進展

楊麗飛 王萍 馬蘇亞

糖尿病腎病（DN）是導致糖尿病患者死亡的主要并發癥之一[1]。目前臨床上對于DN治療僅能夠延緩其進展，并不能完全阻止或逆轉疾病病程。有基礎研究通過建立DN動物模型并針對腎臟炎癥、纖維化和氧化應激等多種分子途徑進行模擬治療，療效不明顯[2]，故開拓新的治療方法仍是當前DN基因治療的研究熱點，而超聲靶向破壞微泡（ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD）是一種安全且高效的治療手段為DN基因治療提供了新思路，本文就UTMD技術及其在DN基因治療中的應用研究進展作一綜述。

1 DN的基因治療

基因治療是一種具有廣泛前景的靶向性生物治療手段，用于治療包括DN在內的各種疾病。與藥物治療所提供的短期效果不同，基因治療可以提供更為持久的治療效果，其針對性強、不良反應小。

Steven等[3]為了探究AC261（一種高選擇性視黃酸受體β2激動劑）在高脂喂養DN小鼠模型中的治療作用，予模型小鼠AC261治療12周后發現，DN小鼠耐受性良好且無明顯不良反應。與單純高脂喂養的DN小鼠相比，AC261治療后的高脂喂養DN小鼠血糖控制改善，蛋白尿和尿白蛋白與肌酐比值降低；且在該組小鼠中，DN的許多細胞特征有所改善，包括腎小管脂滴減少，內皮細胞塌陷、系膜擴張和腎小球基底膜增厚情況好轉。此外，經超微結構和免疫組化分析顯示，經AC261治療后的小鼠足細胞足突和裂隙膈膜形態保持，足細胞裂隙膜蛋白和轉錄因子WT1水平升高。上述結果說明AC261在高脂喂養DN模型小鼠的治療中起積極作用。Wang等[4]使用腎近端小管特異性p53敲除和pifithrin-α（p53抑制劑：PIF）治療的糖尿病小鼠模型研究了p53抑制DN腎纖維化的作用，發現在人腎小管上皮細胞中，PIF對p53的抑制降低了高糖誘導細胞外基質積累，逆轉了高糖對lncRNA鋅指E-box結合同源框1-反義RNA 1（ZEB1-AS1）和ZEB1 mRNA表達水平的抑制作用。上述發現也通過DN患者腎活檢標本得到驗證。說明腎近端小管細胞中p53的藥理抑制和基因缺失可以減輕鏈脲佐菌素（STZ）誘導的DN小鼠腎功能障礙、小管上皮細胞破壞和間質纖維化，表明p53可能是DN腎纖維化的治療靶點。

然而，缺乏安全有效的基因運輸途徑限制了基因療法應用于DN臨床試驗。雖然病毒載體的轉染效率高，但是它存在誘導免疫反應、致癌等臨床問題。因此，尋找安全、有效且高度靶向的基因載體是推進基因治療應用于臨床的關鍵。

2 UTMD技術的應用研究

2.1 UTMD作用機制 UTMD 是一種新興的靶向藥物與基因轉運方法，是目前公認的靶向介導基因轉染和藥物運輸的有效方法。UTMD是指在超聲介導下可實現微泡攜帶藥物的靶向釋放或通過微泡的靶向破壞使病灶區域藥物聚集，增加病灶區域藥物的靶向釋放，提高藥效并減少藥物全身不良反應。

UTMD技術及靶向轉運機制主要是在超聲介導下微泡產生的空化效應及聲孔效應[5]。空化效應則指當介質中微泡暴露在超聲輻照下，隨著超聲頻率的變化產生周期性“膨脹-壓縮”。在低強度聲場中，微泡在細胞附近緩慢均勻振動，產生微流、微噴射等聲學效應，這種空化效應可導致細胞膜滲透性增加或細胞膜損傷，并且在細胞膜表面形成許多大小不等、數量不一的小孔，即聲孔效應[6]。空化效應及聲孔效應可以促進基因和藥物進一步外滲、滲透和細胞吸收。

2.2 UTMD與基因治療 超聲介導的基因傳遞是一種非侵入性的基因靶向轉染方法，可用于傳遞病毒和非病毒載體。超聲微泡造影劑是一種非病毒載體，與其他非病毒基因轉染方法相比，其制備簡單、載基因量大、轉染率高且無免疫原性，可重復使用且安全性高。

UTMD技術為心血管疾病的治療提供了一種非侵入性和非病毒載體的方法，可以有效地將質粒運送到目標區域。有學者為了研究抗凋亡基因survivin在心力衰竭中的治療作用，通過建立由多柔比星誘導的大鼠心力衰竭模型并聯合UTMD技術進行survivin靶向轉運的抗凋亡基因治療[7]。通過PCR、免疫組織化學、超聲心動圖和侵入性血流動力學檢查并分析發現，UTMD聯合survivin治療模型大鼠左心室短軸縮短率顯著升高；此外，實驗組TUNEL和caspase活性的降低以及心肌間質纖維化的減少提示心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡減少。上述實驗說明協同UTMD技術為心血管疾病的治療提供了一個有效治療方法，利用超聲微泡為非病毒載體進行基因的靶向轉染可以增強維持心臟功能和恢復缺血心肌供血的必須因子。

近年來，UTMD介導的基因治療腫瘤領域應用愈發廣泛，如在肝細胞肝癌、鱗狀細胞癌、腎癌等治療方面均獲顯著效果；三陰性乳腺癌（TNBC）是一種侵襲性乳腺癌，由于缺乏孕激素受體、雌激素受體和HER2的表達，其復發率比其他乳腺癌亞型顯著增高，總體生存率也顯著縮短。為提高TNBC的治療效果，Sun等[8]研制了一種新型的多功能陽離子卟啉接枝脂質微泡并載有低氧誘導因子1α（HIF-1α）siRNA。這種微泡載藥量高且藥物提前釋放少，通過實時超聲成像可以輕松監控微泡的分布。此外，通過聯合UTMD技術，該微泡可以在原位高效轉化為納米顆粒，通過空化效應促進卟啉和siRNA在腫瘤部位的積累。HIF-1α siRNA可以下調HIF-1α水平，進而增強光動力療法療效以及部分抑制腫瘤發展。因此，UTMD聯合光動力療法和基因治療被認為是TNBC有效的治療策略。

除心血管、腫瘤領域外，UTMD介導的基因治療亦在其他領域扮演重要角色。Xiang等[9]為了研究經UTMD介導的胰島素樣生長因子1（IGF-1）cDNA和轉化生長因子（TGF-β）短發夾RNA轉染對大鼠跟腱損傷的保護作用。治療后發現，IGF-1+TGF-β+UTMD組模型大鼠黏附指數得分最低、炎癥程度最輕、4，6-二氨基吲哚核計數信號最高、IGF-1表達最高以及TGF-β表達最低；UTMD組比無UTMD組具有更高的轉染效率，且該組的模型大鼠最大荷載和拉應力均大于其他組。總之，IGF-1和TGF-β聯合應用UTMD是一種有前途的體內肌腱損傷治療方法。

UTMD技術所介導的基因治療為各種疾病的治療煥發了新的活力，因其安全、無創、高效且使用簡單應用越來越廣泛，也因微泡與超聲相結合所產生的獨特效應使得特定區域病灶的成像與治療一體化，真正做到了同時監測疾病進展并予以治療的效果。

3 UTMD在DN基因治療中的應用

UTMD作為一種新進基因轉染介導技術，為DN基因治療提供了一種新思路[10-25]。TGF-β/MAD的同系物（SMAD）和NF-κB信號通路在DN炎癥及腎纖維化的發展中起關鍵作用。Chen等[10]研究Smad7在STZ誘導的DN小鼠模型中的保護作用時發現，經UTMD介導的Smad7轉染可顯著降低DN小鼠微量白蛋白尿，減緩了TGF-β/Smad3信號通路介導的腎纖維化以及NF-κB/p65信號通路介導的腎臟炎癥反應的進展。隨后，Ka等[11]進一步確定通過UTMD技術協同Smad7基因治療能夠明顯抑制db/db小鼠糖尿病腎損傷，且實驗證明通過過表達Smad7所改善的2型糖尿病腎損傷與顯著抑制腎臟中TGF-β/SMAD和NF-κB信號通路的激活有關。該研究結果清楚地表明利用UTMD技術聯合腎靶向Smad7基因轉染可以通過同步調節TGF-β/SMAD和NF-κB信號通路來治療2型DN。

近年來發現骨髓間充質干細胞（MSCs）在多種腎臟疾病中的修復中扮演重要角色，Marcelo等[12]也證實了可以通過體外MSCs移植控制DN發生、發展。然而經靜脈移植的MSCs在DN腎臟中檢出率很低且難以到達病變組織，這在極大程度上阻礙了MSCs對損傷腎臟的治療作用，限制了干細胞治療的有效開展。張翊等[13]發現通過聯合UTMD技術可以促進靜脈移植MSCs腎靶向歸巢從而對DN大鼠產生治療效果。結果表明通過外源性MSCs移植可以減輕腎小管和間質損害，而聯合UTMD技術可以促進MSCs遷移、歸巢至腎間質，強化MSCs治療效果。此外，該團隊通過進一步實驗證明UTMD可增加早期DN大鼠腎間質毛細血管通透性且無出血壞死等不良反應，提示UTMD可能是促進藥物、基因、抗纖維化藥物或干細胞進入腎臟的一種有效且安全的治療方法[14]。骨髓MSCs（BMSCs）的遷移和存活主要取決于局部腎臟微環境中的炎癥反應。Wang等[15]證明適當微泡介導的超聲輻照可引起腎臟微環境的改變，進而促進BMSCs對糖尿病腎臟的歸巢能力，且不會引起腎毒性和細胞損傷。

研究發現，基質細胞衍生因子（SDF-1）與其特異性受體CXCR-4可以促進MSCs靶向歸巢，且能增加MSCs在體內的生存效率、抑制MSCs凋亡等作用，從多方面提高MSCs的靶向治療效果[16]。吳盛正[17]通過將SDF-1與微泡共價連接，經靜脈注射并通過超聲靶向爆破釋放SDF-1至DN大鼠模型左側腎臟。與正常大鼠相比，DN大鼠接受UTMD處理后靶向釋放SDF-1后24h MSCs對DN腎臟的靶向歸巢顯著改善。隨后，王龔[18]使用UTMD協同脂質體誘導CXCR-4基因轉染進入BMSCs，并經靜脈移植入DN大鼠腎臟并聯合超聲輻照。結果發現，載CXCR-4質粒可以成功轉染和表達于細胞且聯合UTMD技術協同脂質體可以顯著增加CXCR-4基因在外源BMSCs的轉染效率。此外，聯合UTMD技術能夠增加CXCR-4所修飾BMSCs靶向歸巢DN大鼠腎臟的效率，進一步通過抑制TGF-β1和TNF-α的表達從而改善DN大鼠腎功能。UTMD技術可以利用超聲輻照或協同其他介質增加靜脈移植BMSCs在糖尿病腎臟的靶向歸巢效率并提高DN的治療效果，該技術為今后DN預防和治療提供了一種無創、安全且高效的新方法和新思路。

研究表明在體外條件下，細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4免疫球蛋白（CTLA-4-Ig）可通過對抗高糖環境進而恢復足細胞的生理結構和活性，且進一步實驗證明CTLA-4-Ig可改善甚至消除DN大鼠體內蛋白尿的發生[19]。鄒春鵬[20]研究發現經UTMD技術聯合CTLA-4-Ig可進一步改善DN大鼠腎臟功能，提高該基因原有的生物學效應。Kallistatin（KS）是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，具有抗炎、抗血管生成和抗氧化的特性，而氧化應激在DN的發生、發展中占據重要地位。Yiu等[21]發現經UTMD技術誘導DN小鼠腎小管內KS過表達可通過多種機制包括抑制氧化應激、抗纖維化和抗炎作用、降低血壓等對DN起腎保護作用。

研究發現，microRNA在DN發生、發展中起調控作用，這使它成為目前UTMD介導的基因靶向轉染中的研究熱點。Zhong等[22]利用UTMD技術將microRNA-21敲除的質粒轉染到10周齡db/db小鼠的糖尿病腎臟中并予以治療10周發現，DN小鼠腎臟Smad7表達維持正常水平且TGF-β和NF-κB信號通路的激活受到抑制；DN小鼠的腎臟功能改善、腎臟炎癥、微量白蛋白尿和纖維化減少。MicroRNA-29b是TGF-β/Smad3信號通路所誘導纖維化的下游抑制劑，可作為纖維化的生物標記物，由此推測該基因具有治療DN的潛力。Chen等[23]通過聯合UTMD技術轉染穩定表達microRNA-29b質粒至DN小鼠腎臟并升高腎臟其表達水平，發現microRNA-29b能夠抑制TGF-β所誘導的纖維化和NF-κB誘導的炎癥反應，從而減輕DN癥狀。

王艷等[24]為了研究UTMD聯合連接SelS基因的攜P-選擇素單抗靶向微泡（SMBp）對早期DN的治療效果，構建了2型糖尿病雄性SD大鼠模型。通過對各組大鼠空腹血糖、24h尿蛋白、β2微球蛋白水平等生化指標及AngⅡ、TGF-β1、P-選擇素、SelS 的表達水平進行檢測發現，超聲+SMBp組大鼠上述檢測指標均顯著低于對照組、單純 SelS組、SMBp組，治療效果均優于上述組別。上述結果表明連接SMBp聯合UTMD治療早期DN有顯著療效，是作為防治早期DN的有效手段之一。

Ting等[25]構建雄性SD大鼠早期DN模型，通過將CoQ10與脂質體組裝成CoQ10-脂質體（CoQ10-lip），并利用UTMD技術對早期DN模型大鼠進行治療，同時評價模型大鼠腎臟的形態和功能。實驗結果表明，經CoQ10-lip聯合UTMD治療后，大鼠腎血流動力學明顯改善，其中24h尿蛋白降低、氧化應激指標相應調節提示腎功能恢復。由此可見，CoQ10-lip和超聲微泡的結合對受損腎臟的保護效果也優于其他對比組。這也提示CoQ10-lip聯合UTMD對于逆轉早期DN的可行性。

綜上所述，UTMD技術聯合基因治療為DN治療的臨床開展提供了充分的可能性，也為DN的基因治療盡早應用于臨床打下堅實基礎，更為廣大糖尿病患者早日克服DN困擾帶來福音。

4 問題與展望

UTMD介導的基因轉運在DN的基因治療中扮演重要角色，動物水平已證明其可以提高基因在DN腎臟中的轉染效率，能滿足作為非病毒基因載體的生物學特性需求。但DN基因治療在運用于臨床前仍有許多問題等待解決，例如：（1）如何尋找有效的DN靶向基因以及調控DN發生、發展的信號通路，并以此尋找針對性治療方案；（2）如何增加超聲微泡的載藥率及運輸途中的損失率；（3）如何降低靶向爆破超聲微泡所引起的組織出血、血管內溶血，熱效應以及組織損傷等不良反應。

總之，基因治療有潛力成為一種對抗DN的有效武器，而UTMD技術介導的靶向基因治療具有安全、有效、無創且可重復性高等多種優點，是進一步促進DN基因治療早日應用于臨床的強有力輔助手段。