甲狀腺微小乳頭狀癌患者血漿microRNA差異表達譜的研究

章曉芳 丁金旺 詹宇紅 馬麗珍

甲狀腺微小乳頭狀癌和直徑＜1cm的甲狀腺良性結節在術前主要依靠B超以及甲狀腺細針穿刺鑒別。由于甲狀腺乳頭狀癌（PTC）B超的影像學表現缺乏特異性，而細針穿刺由于結節較小、得到的細胞數量較少難以確診PTC。循環miRNA存在于外周血中，大規模的臨床研究表明檢測患者循環miRNA可以鑒別多種良惡性腫瘤[1]，因此有望成為腫瘤早期診斷的分子標志物。本研究通過miRNA測序法篩選出甲狀腺微小乳頭狀癌與甲狀腺良性結節患者外周血中差異表達的miRNA，并對其生物信息學內容進行分析，為進一步探討miRNA在甲狀腺微小乳頭狀癌早期診斷中的作用提供幫助。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2017年3至7月我院腫瘤外科收治的甲狀腺結節患者，經術后病理診斷為甲狀腺微小乳頭狀癌和甲狀腺良性結節（直徑＜1cm）各5例，兩組均為男2例，女3例，平均年齡分別為42歲和49歲。本研究經我院倫理委員會批準以及所有標本的獲取均經患者同意并簽署知情同意書。

1.2 標本收集 兩組患者入院時即抽取外周靜脈血5ml于EDTA抗凝管中，混勻后即置于4℃或冰盒中保存，并于1h內進行血漿分離；1 500r/min離心10min后得到上層血漿；將血漿轉移至1.5ml無RNA酶（RNase free）中，每個管子吸入200μl血漿進行分離，棄去沉淀的血細胞；將分裝好的血漿置于-80℃保存。

1.3 血漿總RNA提取及質量檢測 使用TRIzol LS Reagent分離提取總RNA，使用NanoDrop ND-1000測定RNA濃度和純度。本研究RNA提取以及質量檢測、測序、數據分析均委托上?？党缮镞M行，10例樣本RNA濃度和純度均達到后續試驗的標準。

1.4 miRNA測序 按照Illumina NextSeq 500儀器說明書中的步驟進行測序。首先使用每個樣品的總RNA制備miRNA測序文庫，然后將文庫變性為單鏈DNA分析，在illumina flow cell上進行捕獲，原料擴增為簇，在測序儀上進行50個cycle測序。

1.5 數據分析 測序完成后，使用Solexa CHASTITY質控篩選原始Reads得到Clean Reads。將Clean Reads去接頭，并留下長度≥15nt的tag得到trimmed Reads。然后，使用 Novoalign 軟件（v2.07.11）將 trimmed Reads比對到合并的pre-miRNAs數據庫上（miRBase v21 pre-miRNAs），最多允許1處錯配。在計算miRNA表達的時候，數量＜2的Reads被舍棄。為了表征異構體的變化，成熟體區域±4nt的Reads被當作成熟miRNA的異構體，并且根據在前體發卡的位置分為5P類和3P類。統計比對到每條成熟miRNA區域（±4nt）上的Reads數作為該miRNA的原始表達量，并使用TPM（tag counts per million miRNA alignments）對樣品進行標準化?；跇藴驶乃衜iRNA異構體的tag數，對實驗計算兩組樣品（有重復）間的P值和倍數變化，并根據P值和倍數變化篩選差異miRNAs。計算兩個樣品（沒有重復）間的倍數變化，并根據倍數變化篩選差異miRNAs。

1.6 聚類圖和靶基因預測以及生物信息學分析 采用mirdbV5和TaregetScan7.1對差異表達miRNA進行靶基因預測，并運用Gene Ontology（GO）分析和KEGG信號通路數據庫富集靶基因以初步分析其功能。GeneR-atio是該GO Term相關的基因數與整個差異基因總數的比值。該值越大代表該GO Term的意義越大。

1.7 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件。計量資料以表示，兩組間比較采用 t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者差異表達的miRNA miRNA測序時選取增加倍數為1.3倍，降低倍數為0.77倍，將P≤0.05的miRNA作為差異表達的miRNA。結果顯示甲狀腺微小乳頭狀癌較甲狀腺良性結節表達量增加的miRNA 3個，減少的miRNA 8個，見表1、2。將這些差異miRNA進行聚類分析如圖1所示（見插頁）。

圖1 甲狀腺微小乳頭狀癌和甲狀腺良性結節差異miRNA聚類圖（PTMC：甲狀腺微小乳頭狀癌；BN：甲狀腺良性結節）

表1 甲狀腺微小乳頭狀癌較甲狀腺良性結節表達量增加的miRNA

表2 甲狀腺微小乳頭狀癌較甲狀腺良性結節表達量減少的miRNA

2.2 靶基因預測 通過 mirdbV5和 TaregetScan7.1對差異表達miRNA進行靶基因預測。上調的3個差異miRNA通過mirdbV5預測共有201個靶基因，通過TaregetScan7.1預測共有412個靶基因，兩者交集靶基因為76個。下調的8個差異miRNA通過mirdbV5預測共有1 145個靶基因，通過TaregetScan7.1預測共有1 057個靶基因，兩者交集靶基因為298個。選取兩個軟件共同預測到的靶基因進一步進行GO和KEGG分析。

2.3 GO分析靶基因的生物學功能預測結果 GO分析共有3種分析方法，生物學過程（biology process，BP），細胞組分（cell compontent，CC）和分子功能（molecular function，MF）。本研究主要進行BP分析。圖2（見插頁）顯示的是上調miRNA預測到的差異基因進行GO分析得到的前10個GO Term，提示蛋白質修飾和細胞分解代謝可能與甲狀腺微小乳頭狀癌發生相關。下調的miRNA預測到差異基因進行GO分析提示代謝過程和生物合成過程可能與甲狀腺微小乳頭狀癌相關（圖3，見插頁）。

圖2 上調miRNA靶基因參與的GeneRatio前10 GO term[GeneRatio：GO Term相關的基因數（Count）與整個差異基因總數（List Total）的比值]

圖3 下調miRNA靶基因參與的GeneRatio前10 GO term[GeneRatio：GO Term相關的基因數（Count）與整個差異基因總數（List Total）的比值]

2.4 差異miRNA靶基因KEGG信號通路預測結果 由于上調miRNA數量較少，KEGG數據庫分析結果提示只有一條信號通路即RNA降解與甲狀腺微小乳頭狀癌相關，參與的基因為PAPD5和TOB1，相關miRNA分別為hsa-miR-532-3p和hsa-miR-636。下調miRNA靶基因通過KEGG分析提示內質網中的蛋白質加工以及HIF-1信號通路可能參與PTMC發生。下調miRNA靶基因參與的GeneRatio前10的信號通路圖4（見插頁）。

圖4 下調miRNA靶基因參與的GeneRatio前10 Pathway term[GeneRaio:Pathway Term相關的基因數（selection Count）與差異基因總數(selection size)的比值]

3 討論

隨著頸部超聲檢查的廣泛應用，甲狀腺結節在普通人群中的發病率非常普遍，呈逐年上升的趨勢[2]。大部分的甲狀腺結節為良性結節，只有5%～10%的結節為惡性，且惡性結節中90%是甲狀腺乳頭狀癌[3]。甲狀腺乳頭狀癌采取手術治療，而良性甲狀腺結節采取定期隨訪的原則[4]。目前甲狀腺結節術前良惡性的判斷主要依靠高頻超聲，但是目前沒有非常特異的B超影像特征可以診斷PTC[5]。在有條件的醫院開展了B超引導下甲狀腺細針穿刺，該項技術目前是甲狀腺結節術前診斷的金標準[6]，具有較高的靈敏度和特異度[7]。由于細針穿刺技術常受限于甲狀腺結節的大小，穿刺抽取細胞數以及血液的污染，以及患者的接受程度，導致細胞學診斷仍不能確診PTC。因此非常有必要發現一種無創的，且靈敏度和特異度較高的、操作簡單的方法早期診斷PTC，為臨床醫生定制治療方案提供可靠依據。

miRNA是一種小的、非蛋白質編碼RNA，通過在轉錄后水平抑制目的mRNA的表達而發揮調節作用[8]。miRNA參與細胞的增值、分化、凋亡、黏附和腫瘤細胞的整個發生過程。miRNA在人類多種腫瘤細胞中表達失調，包括甲狀腺腫瘤[9-10]。大量的研究表明在甲狀腺乳頭狀癌患者和正常人之間存在差異表達的miRNA。盡管這些數據表明miRNA可能是一個鑒別良惡性腫瘤的重要指標，但是缺陷在于只能在術后手術切除標本中進行檢測，不能作為一個早期診斷標記用于指導臨床。

循環中的miRNA存在于血液中，對RNA酶耐受，因此非常容易檢測，操作簡便且可靠性較高。目前關于miRNA的來源不是非常明確，可能來由腫瘤細胞釋放而來，也可能為免疫細胞釋放，凋亡或者壞死的腫瘤細胞釋放等多種途徑而來。大規模的臨床研究證明在多種腫瘤包括甲狀腺腫瘤中循環miRNA可以鑒別良惡性腫瘤，有望成為腫瘤早期診斷的分子標志[10]。

目前關于血清miRNA在甲狀腺腫瘤中的研究目前有4篇影響力較大的報道，2012年我國學者首次通過Solexa sequencing方法發現 let-7e、miRNA-151-5P和miRNA-222在PTC中較良性甲狀腺結節和正常人均增高，且與PTC的TNM分期和腫瘤大小有關[11]。2014年意大利學者報道了白種人PTC血清miRNA-95和miRNA190均較正常人和甲狀腺結節增高，但該研究未發現差異miRNA與PTC臨床特征如腫瘤大小，TNM分期有相關性[12]。2017年該團隊擴大樣本量，在1 000例患者中進一步驗證了這兩個miRNA在甲狀腺乳頭狀癌早期診斷中的意義，研究發現miRNA-190 and-95聯合甲狀腺細針穿刺技術可以明顯提高術前甲狀腺乳頭癌的診斷（靈敏度為96.3%）[13]。而在2015年我國學者發現PTC血清中miR-25-3P和miR-451a較正常人和良性甲狀腺結節患者含量增高，但該研究未分析差異的miRNA與PTC臨床特征的相關性[14]。2016年來自中國學者發現 miR-124-3p、miR-9-3p、miR-4701和 miR-196b-5p在甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺良性結節外周血中具有明顯差異[15]。

鑒于以上結果的不一致性，本研究采用Illumina NextSeq 500測序儀進行miRNA測序分析，結果提示甲狀腺微小乳頭狀和甲狀腺良性結節miRNA表達存在明顯差異，11個差異表達的miRNA與其他研究結果不一致，這可能與選取的樣本有關，本研究選取甲狀腺微小乳頭狀癌以及直徑＜1cm的良性結節，而其他研究大多選取甲狀腺乳頭狀癌，沒有規定大小。miRNA-181與黑色素瘤、急性白血病、非小細胞肺癌均有關[16-18]。本研究首次發現甲狀腺微小乳頭狀癌miRNA較甲狀腺良性結節表達減少，提示miRNA-181可能參與甲狀腺微小乳頭狀癌的發生，為術前進一步明確診斷甲狀腺微小乳頭狀癌提供實驗室依據。miR-30a在甲狀腺乳頭狀癌中表達減少，通過促進IGF-1R促進甲狀腺乳頭狀癌的增值，遷移以及上皮細胞間質變[19]。本研究在PTMC血漿中檢測到miR-30a的含量較低，提示血漿miR-30a可能為鑒別良惡性的指標之一。miRNA-139通過增強fibronectin 1表達促進甲狀腺乳頭狀癌的增值和侵襲[20]，與本研究結果相似，這提示血漿miRNA-139可能為甲狀腺結節良惡性鑒別指標之一。盡管經過文獻查閱提示miR-181、miR-30a、miR-139在甲狀腺乳頭狀癌中表達量減少，與本研究相似，但這3種miRNA能否進一步作為甲狀腺乳頭狀癌術前診斷的指標之一，仍需我們擴大樣本進一步證實。

通過KEGG分析差異miRNA靶基因的信號通路，提示HIF-1信號通路可能參與甲狀腺微小乳頭狀癌的發生，這與文獻報道的結果相似，HIF-1與甲狀腺乳頭狀癌的淋巴結轉移，包膜轉移以及TNM分期相關[21-22]。

甲狀腺微小乳頭狀癌和甲狀腺良性結節miRNA表達譜存在明顯差異，血漿miR-181、miR-30a、miR-139能否作為術前鑒別甲狀腺良惡性結節的指標，還需要進一步擴大樣本進行驗證。盡管樣本數比較少，仍為進一步探討miRNA在微小乳頭狀癌的早期診斷提供理論依據和思路。