重組酶聚合酶擴增技術及其在豬病毒性腹瀉病原基層現場檢測中的應用

于新友

（山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600）

豬病毒性腹瀉是對養豬業危害嚴重的一類疾病，導致仔豬大量死亡，損失慘重，常見豬病毒性腹瀉病原有豬流行性腹瀉（PEDV）、豬傳染性胃腸炎（TGEV）、輪狀病毒（RV）、豬德爾塔冠狀病毒（PDCoV）、豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒（SADS-CoV）、豬嵴病毒（PKV）、豬博卡病毒（PBoV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬圓環病毒 2型（PCV2）等[1-3]。僅靠臨床表現和病變很難將病毒性腹瀉與營養性腹瀉、細菌性腹瀉等進行鑒別，需進行檢測確診，當前常用的檢測方法主要有病毒分離、PCR檢測、熒光PCR檢測、間接免疫熒光等，這些方法耗時長，操作繁瑣，需要復雜的儀器設備，不適合現場檢測。雖然膠體金檢測卡適合現場檢測，但檢測敏感性低、容易漏檢，且市場上產品質量參差不齊。疾病的正確診斷是進行精準防控的前提和基礎，誤診易導致誤治，貽誤病情造成損失。因此急需開發病原現場快速檢測新技術，以及早確診疾病，采取措施，降低養殖場損失。

重組酶聚合酶擴增技術（RPA）是2006年由英國科學家研發的一種核酸恒溫擴增技術[4]。它不需要高溫變性，不需要昂貴的儀器，而是利用多種酶參與，在體外模擬生物體內DNA復制，恒溫條件下短時間內實現靶基因大量擴增，既可以擴增DNA，也可以擴增RNA[5]。其基礎反應體系與其他技術結合，衍生出多種核酸檢測新技術，可以真正實現現場核酸快速檢測。2014年，英國TwistDX公司推出了商業化的RPA檢測試劑盒，有力地推動了該技術在農業、食品、醫學以及生物學檢測等多個領域的推廣應用[6]。RPA技術具有恒溫、快速、便攜、靈敏度高、特異性強、操作簡單等優點[7]，是目前唯一有望替代PCR技術的核酸等溫擴增方法，在基層現場診斷中，具有廣闊的應用前景[8]。本文綜述了RPA技術的原理、產物檢測方式及在豬病毒性腹瀉病原檢測中應用，旨在為豬病毒性腹瀉病原的基層現場檢測提供參考。

1RPA技術介紹

1.1 RPA技術原理

RPA等溫擴增原理與T4噬菌體的DNA復制機制類似，主要利用噬菌體重組酶UvsX及其輔助因子UvsY、寡核普酸引物、單鏈核酸結合蛋白（SSB），鏈置換DNA聚合酶，模板和MgCl2在恒溫下實現核酸擴增產物的指數增長，不需要高溫熱變性[9]。重組酶與寡核普酸引物結合，形成重組酶引物復合物，重組酶引物復合物掃描雙鏈DNA，識別其中一條與引物序列互補的模板DNA并形成D環結構，SSB則與另一條單鏈DNA結合使之穩定。隨后，在ATP作用下重組酶與引物解離，D環消失，引物3′端暴露，在DNA聚合酶作用下，3′端開始延伸擴增，2條引物同時啟動和完成合成過程，不斷重復整個過程，目標產物迅速呈指數增長，一般20 min內即能完成擴增反應。

1.2 產物檢測及衍生技術

RPA擴增產物的檢測方法有多種，目前常用的有3種，即凝膠電泳法、實時熒光RPA（RT-RPA）檢測法及橫向流動試紙條檢測法等[10]。凝膠電泳法所需儀器設備簡單、成本低，但電泳前需要純化擴增產物，否則會有拖尾現象。產物純化和凝膠電泳增加了檢測時間。

RT-RPA檢測時需要額外設計1條exo探針，探針結構完整時熒光強度低，探針與靶序列結合時，連接熒光基團和淬滅基團的堿基類似物被核酸外切酶降解，淬滅基團被釋放，熒光基團發出熒光。3′端進行封閉修飾，以阻止探針充當引物進行擴增反應[11]。與熒光PCR方法類似，需要配備熒光檢測設備，通過熒光信號強弱實現擴增產物定量檢測，可實現多重檢測，但終產物不能再用電泳方式檢測，因擴增產物在反應結束時會被降解。5～15 min即可完成檢測反應，產物不需要開蓋檢測。

橫向流行試紙條檢測，需要額外設計1條nfo探針，并在其下游引物在5′端標記生物素（Biotin），探針上游標記異硫氰酸熒光素（FITC）或6-羧基熒光素（FAM），中間位置采用THF替代一個堿基，3′端進行磷酸化處理。探針長度過短會降低重組率，過長會有非特異性擴增，通常探針濃度為120 nmol/L。擴增反應不需要復雜設備，產物檢測前需要20倍稀釋，室溫下5 min內可完成檢測反應，但如果不稀釋擴增產物容易出現假陽性結果，結果讀取時間超過5 min也容易出現假陽性，擴增產物也可以直接電泳檢測。與膠體金檢測抗原類似，在檢測線上形成“生物素抗體-核酸-納米金粒”復合物顯色。質控線上包被抗FITC或FAM抗體的固定抗體，可直接與帶FAM抗體的納米金顆粒結合，在質控線上顯色，以確保試紙條的有效性。裸眼可觀察結果，對檢測人員要求低，可用于非實驗室環境的現場檢測。

2 RPA技術在豬病毒性腹瀉病原檢測中的應用

呂繼洲等[12]基于PED病毒M基因保守序列，設計一系列擴增引物及其熒光探針，建立了一種PEDV實時熒光RPA等溫檢測方法。結果表明，該實時熒光RPA方法可在39℃恒溫反應20 min特異性擴增PED病毒M基因，與TGEV、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、PCV2及CSFV等對照病毒基因無交叉反應，其檢測限為10拷貝/μL。劉占旭等[13]根據GenBank中公布的PKV基因組序列，設計并合成特異性引物，建立了PKV的RPA快速檢測方法。結果顯示，該方法在38℃恒溫反應30 min即可實現對PKV目的基因片段的有效擴增，以PEDV、TGEV、PDCoV、口蹄疫病毒（FMDV）、PRRSV 為模板時均未檢測到特異性擴增條帶，表明該方法具有良好的特異性，用 3.36×107、3.36×106和 3.36×105copies/L 3個不同濃度的質粒標準品進行重復試驗，均能擴增出特異性條帶，表明該方法具有良好的重復性。該方法檢測的最低限度為3.36×102copies/L的質粒DNA，具有良好的敏感性。肖帥等[14]針對PDCoV N基因設計特異的引物，建立了PDCoV RPA檢測方法。特異性試驗中以PRRSV、PEDV、PKV、TGEV和FMDV為模板時均未產生任何條帶，特異性較好。該檢測方法的靈敏度為103copies/μL，敏感性較好。王金鳳等[15]基于CSFV 5′UTR保守序列，設計特異性引物，建立了可快速檢測CSFV的反轉錄RPA檢測方法。該方法在40℃下恒溫20 min即可完成反應，且特異性強，與其他瘟病毒和豬的重要病原無任何交叉反應。以體外轉錄的CSFV RNA為模板，該方法的檢出下限為102copies。黃超華等[16]以PCV2 Cap基因的保守序列為靶序列，設計并篩選出一組特異性的引物和探針，建立了快速檢測PCV2核酸的RPA方法。結果顯示，該方法特異性強，對豬圓環病毒 1型（PCV1）、PRV、豬細小病病毒（PPV）、PRRSV、CSFV核酸檢測結果均為陰性，靈敏性高，最低可檢出核酸濃度為0.87×10-4ng/μL，簡單快速，且重復性好。劉立兵等[17]基于PRV gB和gE基因保守區域設計引物，建立了PRV野毒和疫苗毒雙重RPA檢測方法，該方法在38℃水浴鍋中恒溫反應20 min，能夠在同一個反應體系中實現對PRV野毒和疫苗毒的特異性鑒別檢測，而與其他常見的豬病毒沒有交叉反應。所建立的雙重RPA方法對PRV gB和gE基因的檢測限均為102拷貝，并且與熒光定量PCR方法檢測限一致。

3 小結與展望

RPA技術自開發以來，深受廣大檢測工作者歡迎，在生命科學領域得到廣泛應用，并衍生出許多新技術，成為恒溫核酸擴增技術的主流，也是最有希望取代PCR的核酸擴增技術。RPA不受場地的限制，不需要昂貴儀器，對溫度要求低，恒溫擴增，時間短，可以在資源匱乏地區實現快速檢測的目的，目前已廣泛用于食品安全及動物疫病檢測。RPA作為一種新興起的檢測技術，也存在著一些缺點和不足。RPA主要利用多種酶實現核酸擴增反應，任何一種酶失活都可致擴增失敗，因擴增體系存在大量蛋白酶，需去除蛋白后才能電泳或后續試驗。RPA所用試劑均來自英國TwistDx公司，單份檢測費用高。引物要求高，無專門設計軟件，僅有篩選原則，需通過手動方式進行大量引物篩選，優化反應體系，增加研發時間和費用。未來RPA技術可能在以下方面進一步突破：1）研發專門引物設計軟件，降低引物設計難度；2）反應溫度范圍拓寬，不局限于某一溫度，可在某溫度范圍內完成擴增反應；3）實現多重檢測，降低成本，提高效率，與基因芯片等其他技術聯合，使結果判定更簡便直觀；4）研發出價格低廉、高效的酶制劑，降低成本。相信隨著技術不斷進步，勢必會引起一場核酸檢測的革命，取代PCR技術在分子檢測中的霸主地位，在豬腹瀉性病毒病原的基層現場檢測中發揮更大的作用。