淺談提高獸醫比對實驗準確性的方法

屈生躍 張書光

(1，云南省盈江縣芒章畜牧獸醫站 678300；2，云南省德宏州動物疫病預防控制中心 678400)

為了加強獸醫系統實驗室能力建設，農業農村部每年都組織省級獸醫實驗室進行檢測能力比對工作。省級比對完成后由各省組織各地州（市）級實驗室參加比對。通過比對，可直觀的衡量出各實驗室檢測能力水平，發現實驗室管理中存在的不足，對獸醫系統實驗室整體工作水平的提高起到積極推動作用。

對比實驗具有可比較性和可重復性，實驗結果容易觀察和辨認，能客觀反映出實驗人員的水平和能力的優點[1]。另外，由于近年來動物防疫工作的需要，有的把實驗結果直接與目標管理考核和績效考評掛鉤，有時一個實驗結果的好壞決定排名先后，甚至是年度工作績效和收入。因此，各地獸醫實驗室非常重視這一實驗。

1 ELISA

ELISA 實驗最難以理解和最重要的就是公式的設定，以小反芻獸疫抗體ELISA 檢測試劑盒說明書為例。（1）計算公式：PI（抑制百分率）=100-（血清樣品 OD 值/M 孔平均 OD 值）×100；（2）結果判定成立條件：結果 PI≥50 為陽性，PI＜50 為陰性。

由于酶標儀只能設定臨界OD 值，所以要根據試劑盒說明書計算出樣品OD 值＜多少為陽性或陰性，很多實驗室人員不會計算。詳細計算方法如下：將樣品OD 值設為X，M 孔平均OD值我們設為機器可以判定的PC1，帶入計算公式可以得出PI=100-（X/PC1）×100，根據 PI≥50 為陽性得出：100-（X/PC1）×100≥50 為陽性，解不等式解出 X≦0.5×PC1 為陽性，反之為陰性。因此樣品 OD 值的臨界值為 0.5×PC1，將 0.5×PC1 輸入機器即可完成機器公式的設定，陰陽性對照成立條件計算方法是將陰陽性對照作為血清樣品，同上計算出臨界值即可。

2 血凝與血凝抑制實驗

2.1 1%紅細胞懸液的配制

洗紅細胞要保證紅細胞不能破裂，洗紅細胞要洗3～5 次，直上清清亮為止，移取時盡量輕取輕放；當紅細胞配制濃度偏低時，終點判定很容易出現錯誤，這也多是找不到實驗失敗原因的主要問題。

2.2 血凝實驗

為準確測量出血凝結，一般要求做3 排相同的實驗。加紅細胞要注意防止" 掛滴” 現象的發生 (紅細胞沒有全部加到孔中，而是有一部分掛在吸嘴尖上)。HA 實驗結果判斷時要求將板傾斜45°，觀察沉積紅細胞流淌情況，凡是有流淌的都不能算成100%凝集。掌握100%紅細胞凝集作為血凝實驗的終點很重要，如果終點孔中心有點狀沉積，都對以后的實驗有較大的影響。紅細胞沒有充分打散或采血后血液與抗凝劑沒有充分混勻常出現這種情況。

2.3 抗原回測

抗原回測是適時檢測4 單位抗原配制是否準確的重要方法[2]。從左至右第一列為4 單位抗原，第二列為2 單位抗原，第三列為一單位抗原，第四列為1/2 單位抗原。如果前三孔凝集，第四孔不凝集，則4 單位抗原準確無誤；若4 孔都凝集，表示抗原濃度偏高；若前兩孔凝集，3、4 孔不凝集，則表示抗原濃度偏低。過高或者過低都建議重新配制，以免影響血凝抑制實驗結果準確性。

3 PCR

3.1 所有使用耗材的滅菌

參加比對實驗前，一定要對所有用到的實驗耗材進行高壓滅菌和干燥，防止交叉污染。

3.2 提取核酸

建議使用全自動核酸提取儀進行核酸提取，減少人為提取核酸造成的誤差；兩個人做平行實驗，同時提取。

3.3 PCR 和電泳

PCR 配體系、加樣和電泳都設置兩人平行操作，結果完全相同則直接提交結果，結果不一致的以業務水平較高的為準。

4 討論

3 個實驗最容易出錯的是血凝和血凝抑制實驗，任何一個環節的失誤都會前功盡棄，因此，參加比對實驗時建議將血凝和血凝抑制實驗分成兩步：第一步血凝實驗、4 單位抗原配制和抗原回測，若抗原回測完全正確再開始第二步，如果抗原回測一直不正確或者血凝實驗結果異常，一定要重新買雞從頭開始；第二步再加盲樣進行血凝抑制實驗。血凝抑制實驗每一步也建議設置平行對照，兩人做出的結果分析評定后再行提交。