腎移植術前免疫致敏評估的研究進展

王 婷，趙帥林，楊關印，高寶山，徐志強

(1.吉林大學第一醫院 泌尿外二科，吉林 長春130021；2.通遼市醫院 泌尿外科，內蒙古 通遼028000)

腎移植是終末期腎功衰竭患者的最佳治療方法。由于強效免疫抑制劑的應用，移植術后短期急性排斥反應明顯減少，然而移植腎長期存活率仍有待提高。人類白細胞抗原(HLA)的免疫致敏被認為是影響移植腎存活的主要原因。因此充分了解實驗室如何評估HLA的致敏作用，對于判斷器官移植潛在受者是否可接受供者的器官、圍手術期決策制定、預測手術風險及遠期影響至關重要。本文以HLA抗原和抗體為中心，闡述移植術前HLA實驗室檢測在免疫學風險評估中的作用、檢測HLA致敏的方法、結果解讀及其局限性，為準確評估腎移植免疫風險、提高移植物遠期存活提供依據。

1 致敏的定義

器官移植前的評估中，致敏是在潛在受者中檢測是否存在對一種或多種HLA抗原具有反應性的抗體。由于其在移植免疫中的重要性，HLA基因及相應的抗原得到了廣泛的研究，且越來越多的等位基因被發現[1]。受早期檢測技術的限制，僅HLA A、B和DR抗原及相應抗體得到了較深入的研究。然而通過研究已逐漸認識到所有HLA基因的差異均可能導致同種異體識別及免疫損傷[2]。

抗原應答的產生需要向T細胞和B細胞提呈抗原，并產生促進T細胞及B細胞活化的信號。因此致敏的產生需要兩個關鍵因素—抗原的暴露及能夠對抗原做出反應的免疫系統。典型的致敏過程包括妊娠、輸血及既往器官移植。在這些過程中均存在非自身組織的引入，且非自身抗原可能提呈給T細胞和B細胞[3]。如果宿主識別了與自身HLA抗原不同的抗原，并且除T細胞介導的炎癥途徑之外，B細胞途徑也可被激活，就可在外周血中產生和檢測出抗HLA抗體。此外記憶性B細胞途徑可被激活，如循環抗體減弱，記憶性抗體應答仍可在再刺激時快速產生。如果循環HLA抗體對移植物表達的抗原具有特異性且具有足夠高的滴度，則免疫系統可完全激活并破壞移植物內皮，此經典過程稱為超急性排斥。介導損傷的抗體常常會緩慢出現，隨著檢測技術的進步，研究人員逐漸認識到，可檢測出的抗體直接導致的臨床后果并非是絕對的，而且在檢測中可能得到非特異性結果[4]。此時需要臨床醫生及HLA實驗室共同解讀，而不是接受簡單的陽性或陰性結果。

2 HLA實驗室檢測和移植前風險評估

在臨床HLA實驗室中檢測免疫致敏的平臺主要有HLA分型，HLA抗體檢測和交叉匹配。腎移植候補名單面臨的主要問題是為移植受者找到HLA匹配的供體，這就需要了解潛在受體中HLA抗體的特異性和強度以及潛在供體中HLA抗原出現的頻率。目前移植前需要著重了解的是受者體內是否存在供體特異性抗體(donor specific antibody，DSA)[5,6]，從而避免高風險移植或移植后加強免疫抑制治療以降低移植物排斥的風險。器官移植后記憶性同種異體免疫的形成或新生HLA抗體意味著移植物發生急性和慢性抗體介導損傷的風險更高。

3 HLA分型

受檢測試劑及檢測方法的限制，傳統的腎移植HLA分型主要包括HLA-A、HLA-B及HLA-DR。傳統檢測方法是將受體細胞與已知抗HLA抗體血清共孵育，通過觀察細胞死亡來確定分型。這種檢測方法已被基于反向序列特異性寡核苷酸引物(R-SSO)或序列特異性引物(SSP)的聚合酶鏈反應(PCR)技術所取代。此檢測中，由于使用的是給定的HLA基因相關引物，因此受者DNA通過PCR僅以給定的類型發生擴增，通過分析哪種引物導致擴增即可鑒定HLA的基因型。R-SSO和SSP技術可在數小時內提供結果，且可以檢測任何人的HLA蛋白分型，即 A、B、Cw、DR、DRw、DQ、DP。以往0/6錯配被認為是最佳匹配，而6/6錯配為最差匹配(由HLA-A、B、DR各2個抗原之間的差異所定義)。供受者之間的錯配程度對移植物長期存活有顯著影響[7,8]。研究發現，包括HLA-Cw、HLA-DP和HLA-DQ在內的所有HLA蛋白都是可導致抗體形成的抗原性靶標，并對移植物存活產生影響[9-11]。目前已知的抗HLA-II類抗體大多數為抗HLA-DQ抗體[12]。

從血清學分型到基于PCR分子分型的轉變使得HLA分型更為精細和準確。由于血清學方法依賴于完整的抗原—抗體反應，因此并不能輕易區分那些編碼蛋白質大體相同但免疫原性具有微小差異的等位基因。而特定的分子引物能夠對等位基因變異歸類分型，可檢測到僅有單個氨基酸不同的等位基因變異，因此目前標準化的HLA分型已被廣泛應用。“*”用于表示該結果通過分子學方法獲得，在第一個區域中所報告的基因位點，與第二個區域中與之相關的等位基因由“:”加以分隔，例如HLA-A * 02：01格式，該分子分型所對應的血清學結果為HLA-A2。分子分型目前不僅可以區分等位基因，還可以區分特定的蛋白質、DNA變異和非編碼區域內的變化。因此，一個“完整”的分型格式可以具有多達四個標識符，例如 HLA-A * 03：01：01：02 N[13]。因為機體可能會針對具有微小的但具有免疫原性的等位基因差異(例如HLA A * 02:01與A * 02:03)的相同抗原組(例如HLA-A2)的蛋白質而產生抗體，通常在實體器官移植中僅考慮前兩個區域中的差異(代表抗原的蛋白質整體結構中的氨基酸差異)。

HLA分型的命名法進一步發展以更好地描述II類HLA-DP和DQ蛋白的結構和作用。HLA II類蛋白的結構具有更復雜的抗原性潛力。任何HLA分子(Ⅰ類和Ⅱ類)的關鍵抗原區域是肽結合凹槽(圍繞β折疊的兩個α螺旋)，在此區域發生的抗原提呈是HLA分子的天然生物學功能。在HLA I類分子中，凹槽完全位于單個α蛋白鏈中，所有表位的多態性都位于其中，β鏈或恒定鏈在個體之間是高度保守和單態的，因此不會產生抗體反應。相反，HLA II類分子的α和β肽鏈均具有抗原潛力，并可能具有獨立的免疫原性。進一步認識移植受體可能產生針對α鏈表位、β鏈表位及α鏈與β鏈交界面的抗體，需要HLA分型完整性和抗體檢測報告的發展[14,15]。HLA II類抗原傳統上僅根據β鏈命名，但如果要充分描述供體和受體之間潛在的免疫原性，則須清楚地區分及鑒定α等位基因，并將不同的α-β組合抗原識別為潛在的免疫靶標[16]。而針對DQ抗原形成的抗體大約四分之一以DQA和DQB混合的形式存在，這種形式很難被單抗體包被的微球檢測所識別[16]。

4 抗體的檢測及鑒定

通過輸血、妊娠及既往移植而接觸到非自身HLA抗原可導致抗HLA抗體的產生[17,18]。移植前準確鑒別這些抗體有助于器官移植受者避免表達供體抗原的移植物的免疫刺激。臨床上檢測到的器官移植受體預存的相關抗體是在供體抗原刺激下產生的，此類抗體會導致急性或慢性移植物排斥反應。

早期HLA抗體的檢測是利用補體依賴的細胞毒(CDC)的方法。如果受體預先生成DSA，受體血清與供體細胞共同培養后將導致抗原-抗體復合物的形成。向培養物中加入外源性補體，形成的抗原-抗體復合物將激活補體途徑，隨后可出現細胞毒性作用及細胞死亡。供體死亡淋巴細胞比例>20%通常表示受體血清中存在DSA。此方法為定性診斷，結果受操作流程影響較大，同時細胞死亡也可能受培養條件及樣品處理的影響，因此精準度具有一定局限性。而且同時須進行陽性(具有已知HLA抗體的血清)和陰性(已知缺乏特定HLA抗體的血清)對照。要激活補體途徑則需要高滴度的DSA，如抗體滴度不足以導致細胞死亡，則檢測結果可能是假陰性，但同等滴度的抗體含量仍可能導致同種異體移植物損傷。此檢測中可添加抗人球蛋白(AHG)來改善CDC方法的靈敏度。AHG可促進補體活化并因此在DSA存在的條件下發生更強的陽性反應，將供體淋巴細胞分為T細胞或B細胞共同培養，進而分別鑒定HLA Ⅰ類和/或Ⅱ類抗體。

CDC方法可通過檢測群體反應抗體(PRA)來估測移植受者血清對特定人群HLA抗原的反應概率。用于檢測的淋巴細胞組合通常來自當地人群(通常50-60人)，此方法可粗略估算移植受者對人群中HLA抗原具有反應性的百分比(死亡淋巴細胞的百分比)，從而估算對于該群體而言免疫學上不能進行移植的供體的百分比。應用此檢測方法也可發現滴度最強的HLA抗體及最常見的陽性HLA抗體，但該方法可能因淋巴細胞組合的不同出現檢測偏差，譬如所選擇的淋巴細胞組合中不包括罕見的HLA抗原，或組合中包含過多重復抗原，檢測結果將會出現較大的差異。有研究發現，部分非HLA抗體如內皮細胞抗體和血管緊張素抗體均可影響腎移植預后，此類抗體對移植物的影響越來越受到關注[19,20]，但這類抗體并不能被PRA檢測所發現。

在血清學HLA分型方法被基于分子DNA檢測平臺取代的同時，抗HLA抗體的血清學鑒定也逐漸被更靈敏和特異的基于流式細胞術的各類固相檢測方法所取代。這些固相檢測法使用包被HLA抗原的微球[21]。如果檢測到抗原，可以使用單抗原微球(SAB)進一步精確的鑒定其特異性，其原理為每個單抗原微球表面包被一種來自患者細胞系的Ⅰ類或Ⅱ類抗原，因此除了罕見表型以外，所有常見的HLA抗原都可以用此方法檢測[22]。將包被抗原的微球與待檢測抗體共孵育，并加入與熒光染料相結合的抗人球蛋白抗體，如果血清內抗體與HLA抗原上的表位相結合，則可通過流式細胞術檢測出熒光染料包被的抗球蛋白抗體-微球復合物。由于此檢測方法靈敏度較高，因此血清內可能導致移植物損傷的低濃度抗體也可檢測出來[22,23]。

5 交叉匹配

移植受體對目標供體反應性的最后一種評估方法是交叉匹配。傳統的基于細胞反應的交叉配型使用上文提及的相同的CDC方法。但與前者的關鍵區別在于，此檢測所有供體的HLA抗原都將被用到，無論其在人群中的總體普遍性如何。但此檢測仍然存在敏感性及特異性問題(例如存在非HLA抗體、自身抗體或低濃度的DSA)，因此正確解讀檢測結果對于有效規避高風險移植但不會因誤判而舍棄適合移植的器官來說至關重要。

流式細胞技術的發展及抗人球蛋白的應用，改善了交叉配型檢測的靈敏度[24]，與基于流式細胞術的固相抗體檢測相似，當受者血清與供體細胞共同培養時，可通過熒光標記的抗人IgG檢測受者血清中低滴度的DSA。研究發現通過此方法檢測出的更低滴度的抗體，仍與器官移植后移植物短期及長期的排斥反應有關[25]，而此滴度下的抗體應用基于補體反應的交叉配型檢測則是陰性的。

交叉配型應包括T淋巴細胞(表達Ⅰ類HLA抗原)和B淋巴細胞(表達Ⅰ類和Ⅱ類HLA抗原)，以及自身交叉配型用以控制與自身抗體相關的假陽性結果。為了確保陽性交叉配型結果具有免疫學相關性，所有交叉配型檢測最好通過SAB完成[26,27]。相反，如果T細胞及B細胞交叉匹配均為陽性，而自身交叉匹配結果也為陽性，但檢測不到DSA，則可能是由于免疫學上無關的自身抗體所導致的，不應排除移植的可能性。

6 HLA實驗室檢測在移植前臨床實踐和決策中所起的作用

6.1等待名單或移植前候選人由于個體內的循環抗體含量可隨著時間的推移增多或減少，因此在等待移植的同時應定期檢測HLA抗體以確保最準確反映個體的免疫潛能。再次免疫暴露時可能發生劇烈的抗體反應，因此應在致敏事件4-6周后重復檢測HLA抗體。然后可將抗體特異性列表與已知群體內的供體HLA頻率進行比較[28,29]，以生成計算的PRA(cPRA)。cPRA的準確性取決于組織配型庫中多個位點的供體分型的完整性，HLA分型數據越完整，得到的cPRA值越準確[30]。并可利用這些cPRA值來管理等待移植名單上高度致敏的潛在受者從而對其進行優先排序，為患者提供移植機會的參考[31,32]。然而cPRA值并不能單獨用于量化排斥反應的免疫風險。

對于高致敏的等待患者需要改變供體器官分配理念，以確保他們在等待名單中不會處于劣勢地位[33]。當移植風險較低時，可預先嘗試去抗體策略。此外，部分移植中心嘗試開展了腎臟配對交換方案，其中不適合其預期受者的活體供體可能是另一患者的合適供體，而這位患者的原始供體又可能依次與另一受者相匹配。該策略增加了移植成功的機率并有效縮短了等待移植的時間[34,35]。 對于cPRA值非常高(>95%)的個體也可通過脫敏方案來提高其獲得移植的機會[36]。通過血漿置換或免疫吸附去除預存的抗HLA抗體、使用靜脈內免疫球蛋白調節抗體產生、使用利妥昔單抗或硼替佐米靶向清除B細胞以減少抗體產生及應用依庫麗單抗阻斷補體激活等方案單獨應用或聯合應用均取得了不同程度的療效[37-39]。盡管抗體脫敏方案需密集治療，但與持續血液透析相比，其成本效益比仍具有優勢[40,41]，已經使美國[42]和加拿大[43]的器官分配模式發生了變化。

6.2 器官移植時HLA檢測的應用在某一潛在供體被確定后且即將進行移植時，需進行HLA供體分型并與受體分型進行比較，因為供體和受體之間的HLA錯配程度是刺激同種免疫應答的基礎。研究發現，供受體間HLA錯配的數量與DSA形成及移植腎排斥反應呈正相關性[44]。以往認為，首次和再次移植發生HLA錯配會導致移植結果更差，然而最新數據顯示，這種風險僅限于特定的亞組，包括HLA II類分子重復錯配的患者及腎切除的患者[45]。一些移植中心使用HLA流式檢測的平均熒光強度(MFI)來確定檢測的抗體是否應包含在計算機虛擬交叉匹配中，然而MFI并非定量結果，修訂的SAB檢測法把檢測C1q片段用以衡量HLA抗體的補體結合能力，從而確定哪些抗體是有害的[46]。然而這些檢測結果均不是絕對的，移植前C1q陰性的DSA未必無害，在某些情況下仍可造成移植物失功及不良后果[47]。因此，任何陽性或陰性結果必須在組織相容性檢測結果的背景下解讀，以確保假陽性或假陰性結果對移植分配決策的影響降至最低。

7 結語

器官移植前的所有檢測都旨在為風險評估提供依據，然而移植實踐中的臨床風險評估與其他醫學領域一樣，并非絕對。目前尚無一個檢測結果是絕對禁止移植的依據，而是在確定的高風險供者的前提下權衡可能的風險與獲益。值得關注的是，基于HLA的同種免疫是高度動態的，且在短期內可能因免疫刺激或免疫抑制的狀態而發生改變。鑒于HLA實驗室檢測結果的復雜性，建議應用動態數據并結合其他臨床檢測結果為移植風險評估提供依據。