黃芩苷對人肺成纖維細胞增殖及FN蛋白的影響

苗永迪，劉文曄，趙 雷，趙書涵，豈 蕊，王隱瑜，鄭晨曦，孫 聰

(長春中醫藥大學，吉林 長春130117)

肺纖維化(PF)是臨床上常見的疾病[1,2]。黃芩苷是中藥黃芩的活性成分，黃芩苷可抑制成纖維細胞合成相應基質從而介導炎癥性疾病的發生。本研究利用不同濃度的黃芩苷干預體外培養的肺成纖維細胞，結合分子生物學技術觀察中藥單體黃芩苷對人肺成纖維細胞中纖維黏連蛋白(FN)的mRNA及蛋白表達，探討黃芩苷抑制人肺成纖維細胞增殖的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1細胞系 HFL1細胞系(人肺成纖維細胞體外培養細胞系)購于中國科學院上海細胞庫，置于10%優級胎牛血清Hepes調節的DMEM細胞培養基中培養。

1.1.2主要試劑 黃芩苷純度為91.7%，編號為XEBJ-6RQ3，購自中國藥品檢定研究所；醋酸潑尼松片，生產批號為20131114，購自天津天藥藥業股份有限公司；逆轉錄試劑盒、FN polyclonal antibody購自杭州博日生物科技。

1.1.3引物 引物由上海生工合成，序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.2 方法

1.2.1HFL1細胞培養 將細胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養基進行細胞復蘇，放置恒溫培養箱中傳代培養，培養箱參數設置為37℃、5%CO2。每天固定時間觀察細胞生長狀態，待培養瓶內的細胞長至90%以上時，加2 ml的0.25%胰酶進行消化90 s，計數傳代。

1.2.2細胞分組及給藥 將混懸后的細胞隨機分為5組，即陽性藥組、黃芩苷高濃度組、黃芩苷中濃度組、黃芩苷低濃度組、空白組，每組細胞為2×105。精密稱取黃芩苷，用DMEM培養基稀釋濃度依次為10 mM、5 mM和1 mM，稱取醋酸潑尼松片于DMEM培養基中溶解，配成終濃度為1 mM，將細胞混懸液進行離心棄去上清液，加入含有相應藥物的培養基。

1.2.3細胞增殖抑制率檢測 當培養瓶內的細胞處于對數生長期時加入0.25%胰蛋白酶進行消化，使貼壁的細胞吹打成混懸液，并接種在96孔板中。繼續培養細胞至貼壁狀態，加入含有黃芩苷的培養基，每組在培養24 h，48 h和72 h后加MTT 20 μl，繼續孵育4 h，離心棄掉上清，加入DMSO試劑150 μl，室溫振蕩20 min。待晶體溶解后測570 nm處的吸光度，每組設5個復孔，記錄結果。

1.2.4mRNA檢測 選用β-actin為內參，Trizol法進行總RNA提取，RT-PCR擴增步驟根據說明書進行操作。本擴增體系共循環30次，最后保持72℃延伸10 min。0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測FN的擴增產物，上樣順序為陽性藥組、黃芩苷高濃度組、黃芩苷中濃度組、黃芩苷低濃度組、空白組。反應條件如表2。

1.2.5蛋白檢測 將混勻后的細胞液離心棄上清，加細胞裂解液提取總蛋白，煮沸使蛋白變性，SDS-PAGE電泳上樣量為10 μl，封閉液封閉3 h，一抗(β-actin、FN)4℃孵育過夜，PBST洗膜后二抗孵育1 h，洗膜后DAB顯色，利用凝膠成像系統進行灰度值掃描。

表2 PCR反應條件

1.2.6統計學分析 Image J軟件對NC膜上的條帶灰度分析，利用SPSS19.0軟件對數據分析，采用單因素方差分析，比較組間差異。

2 結果

2.1 MTT檢測細胞增殖抑制率

空白組細胞生長狀態良好，無懸浮細胞且生長速度快、貼壁面積分布廣；醋酸潑尼松陽性藥組有半數細胞呈懸浮狀態，隨時間增長懸浮量呈逐漸上升趨勢；黃芩苷各濃度組部分細胞懸浮于培養瓶中，高濃度組較多，中濃度組次之，低濃度組較少。各給藥組干預細胞72 h，細胞增殖抑制率結果見表3，MTT結果表明黃芩苷對HFL1細胞有較大程度的增殖抑制效果，高濃度組抑制最為明顯，與空白組比較有統計學差異(P<0.05)。

表3 MTT測定細胞增殖抑制率

2.2 FN mRNA表達結果

醋酸潑尼松組和黃芩苷各濃度組干預下，FN mRNA表達明顯下降，與空白組比較有顯著差異(P<0.01)；組間差異比較結果顯示，FN mRNA黃芩苷高濃度組與中、低濃度組相比有顯著差異(P<0.01)，FN mRNA中濃度組與低濃度組比較有差異(P<0.05)，如圖1。

注：與空白組比較△P<0.01，與醋酸潑尼松組比較▲P<0.01

2.3 FN蛋白表達結果

在黃芩苷和醋酸潑尼松干預下，HFL1細胞中FN蛋白表達水平均有下降，FN蛋白黃芩苷高、中濃度組、醋酸潑尼松組相比空白組，有顯著統計學差異(P<0.01)，低濃度組與空白組相比無統計學差異(P>0.05)。FN蛋白黃芩苷高、中、低濃度組與醋酸潑尼松組相比，有顯著性差異(P<0.01)，FN蛋白高濃度組與中、低濃度組比較均有顯著性差異(P<0.01)，中濃度組與低濃度組比較亦有顯著性差異(P<0.01)，如圖2。

注：與空白組比較△P<0.01,與醋酸潑尼松組比較▲P<0.01

3 討論

肺纖維化的發生發展過程中，HFL1的增殖受大量細胞因子的調控，在體內細胞因子的正性與負性調控失衡時，引起肺成纖維細胞的大量增殖，進而誘發肺纖維化[3]。FN是廣泛存在的非膠原糖蛋白，肺纖維化病變時肺內FN含量明顯增高，提示FN早期存在于肺成纖維細胞中，對肺纖維化的形成有一定的影響[4，5]。本實驗通過體外培養HFL1細胞，以醋酸潑尼松為陽性藥對照組，觀察黃芩苷高濃度組10 mM、中濃度組5 mM和低濃度組1 mM干預HFL1的增殖效果，孵育72 h后MTT法檢測細胞的增殖抑制率，分子生物學技術檢測給藥干預后HFL1細胞中FN蛋白及mRNA的表達。結果發現黃芩苷對HFL1細胞抑制效果呈濃度依賴性，高濃度組與陽性藥組抑制效果相當，說明黃芩苷可有效的抑制HFL1細胞的增殖；Western-blotting和RT-PCR結果顯示，黃芩苷可有效降低FN蛋白及mRNA的表達，且濃度在10 mM、5 mM時效果明顯，與空白組比較有顯著差異，表明FN在轉錄及翻譯過程中均受抑制，提示黃芩苷的抑制作用在RNA水平已有較好的效果，為后續轉錄組學的研究提供基礎。肺纖維化的發生發展與FN表達量密切相關，本研究證實黃芩苷可有效抑制FN的表達，進而改善肺纖維化的病變，為臨床治療肺纖維化提供理論依據。