葡萄酒中農(nóng)藥殘留檢測的前處理方法研究進展

郭亞蕓，史紅梅，韓曉梅，于清琴*

（山東省葡萄研究院/山東省葡萄栽培與精深加工工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華東都市農(nóng)業(yè)重點實驗室，山東濟南 250100）

隨著生活水平的提高，人們越來越注意飲食的健康問題。飲酒愛好也逐漸由高度酒向低度酒轉(zhuǎn)變，糧食酒向果酒轉(zhuǎn)變。由于葡萄酒中含有天然的抗氧化劑，適量飲用有益于人體健康，因此，葡萄酒成為世界上最受歡迎的含酒精飲料之一。

葡萄酒是由新鮮葡萄或葡萄汁經(jīng)過發(fā)酵產(chǎn)生的含酒精飲料。在葡萄生長期間，為了提高產(chǎn)量和品質(zhì)，或多或少會應(yīng)用農(nóng)藥[1]，一些農(nóng)藥施用后不易分解，尤其是采摘前噴施的農(nóng)藥，會不同程度的殘留在果實上，然后通過發(fā)酵進入葡萄酒中[2]。雖然葡萄酒屬于農(nóng)業(yè)深加工產(chǎn)品，它的整個生產(chǎn)過程涉及許多不同的復(fù)雜技術(shù)，尤其是酒精發(fā)酵過程，可以減少農(nóng)藥的殘留量，但仍有一部分農(nóng)藥殘留在葡萄酒中[3]。比如葡萄生長中經(jīng)常噴施的嘧霉胺和嘧菌酯等殺菌劑，在葡萄酒釀造過程中的物理、化學(xué)和生物反應(yīng)中不易分解，導(dǎo)致在葡萄酒樣品中可檢測到大量殺菌劑殘留[4]。甚至還有一些農(nóng)藥如樂果、敵百蟲、甲霜靈等，經(jīng)過發(fā)酵過程后可以轉(zhuǎn)化成毒性更強、對人體及環(huán)境危害更大的化學(xué)物質(zhì)[5]。人體若是長期進食含有農(nóng)藥的葡萄酒后，就會在體內(nèi)積累，引起慢性中毒，因此，人們對葡萄酒的安全性要求在不斷提高，葡萄酒中農(nóng)藥殘留量的檢測就顯得尤為重要。

目前，國內(nèi)外葡萄酒中農(nóng)藥殘留檢測方法一般包括樣品前處理和儀器分析兩部分。由于葡萄酒中農(nóng)藥殘留量低，且葡萄酒基體復(fù)雜，若不進行有效的樣品前處理，會對后續(xù)的儀器分析結(jié)果產(chǎn)生影響，因此，樣品前處理技術(shù)的好壞成為制約農(nóng)藥殘留檢測是否成功的關(guān)鍵。本文對葡萄酒農(nóng)藥殘留檢測方法的樣品前處理技術(shù)進行綜述，旨在為葡萄酒農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)的進一步研究和發(fā)展提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)參考，保證葡萄酒中的農(nóng)藥殘留限制在安全范圍，提高消費者食品安全意識[2,6]。

1 葡萄酒中農(nóng)藥殘留檢測常見前處理方法

1.1 液液萃取法（liquid-liquid extraction，LLE）

液液萃取作為一種前處理方法，其萃取過程無需特殊裝置和材料。但是，液液萃取試驗操作繁瑣、費時，并且試驗中使用大量有機溶劑，對人體和環(huán)境危害較大，因此，此方法在農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用越來越少。王春利等[6]采用體積比為1：1的正己烷和乙酸乙酯的混合溶液作為萃取劑，通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用進行檢測，建立了液液萃取-氣相色譜-質(zhì)譜快速檢測葡萄酒中14種農(nóng)藥殘留的方法。

1.2 固相萃取法（solid phase extraction，SPE）

固相萃取技術(shù)是上世紀80年代中期發(fā)展起來的一項樣品前處理技術(shù)，主要用于復(fù)雜樣品的分離、富集和凈化，旨在降低樣品基質(zhì)干擾，提高檢測靈敏度，同時也達到了保護分析儀器的效果。與傳統(tǒng)的液液萃取法相比，固相萃取技術(shù)可以提高分析物的回收率。吳鳳琪等[7]的試驗中采用二氯甲烷作為葡萄酒樣中農(nóng)藥殘留的提取溶劑，然后經(jīng)固相萃取柱凈化，氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀檢測，建立了固相萃取-氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法分析葡萄酒中常見75種禁限用農(nóng)藥殘留量的方法，該方法準確度高、精密度好，在選擇反應(yīng)監(jiān)測離子的模式下對葡萄酒中75種農(nóng)藥殘留進行了質(zhì)譜定性和內(nèi)標法定量。趙建暉等[8]采用乙腈提取葡萄酒樣中農(nóng)藥殘留，CARB/PSA雙層固相萃取小柱凈化，建立固相萃取-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析葡萄酒中常見27種禁限用農(nóng)藥殘留的方法。蔣宏等[9]采用C18固相萃取小柱對葡萄酒中17種常見禁限用農(nóng)藥殘留進行富集、凈化，與氣相色譜/負化學(xué)離子源質(zhì)譜聯(lián)用，建立17種殘留農(nóng)藥的檢測方法。李曉燕等[10]采用Pesti Carb-NH2固相萃取柱對葡萄酒中有機氯農(nóng)藥六六六4種同分異構(gòu)體殘留進行富集、凈化，并與氣相色譜聯(lián)用，建立葡萄酒中農(nóng)藥六六六4種同分異構(gòu)體殘留量的檢測方法，用該方法對市售的4種國產(chǎn)葡萄酒中α-六六六、β-六六六、γ-六六六和δ-六六六進行檢測，結(jié)果顯示，4個葡萄酒樣均檢出有機氯農(nóng)藥六六六的4種同分異構(gòu)體。莊麗麗等[11]采用HLB小柱和LC-NH2小柱對葡萄酒中有機磷農(nóng)藥殘留進行富集、凈化，與氣相色譜火焰光度技術(shù)聯(lián)用，建立葡萄酒中有機磷農(nóng)藥殘留的檢測方法，并用該方法對2款白葡萄酒和5款紅葡萄酒中的16種有機磷農(nóng)藥進行檢測，甲基硫環(huán)磷在1款紅葡萄酒中檢出，甲基對硫磷在2款紅葡萄酒和1款白葡萄酒中檢出，地蟲硫磷在1款紅葡萄酒中檢出，濃度均小于0.01 mg/kg。由于固相萃取試驗過程中使用大量有機溶劑，對人體和環(huán)境危害較大，且固相萃取小柱成本較高，因此，新型的綠色環(huán)保前處理技術(shù)越來越多被人們關(guān)注。

1.3 固相微萃取法（solid phase microextraction，SPME）

固相微萃取法是在固相萃取法的基礎(chǔ)上建立起來的一種集富集、凈化、進樣于一體的綠色環(huán)保型前處理方法。此方法不使用有機溶劑，有3種萃取形式，即浸入式萃取、頂空萃取和膜保護萃取形式。早在1998年，Matteo等[12]就已經(jīng)采用商品化的100 μm聚二甲基硅氧烷（PDMS）萃取頭，以浸入式固相微萃取方式與氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用，建立了葡萄酒中農(nóng)藥殘留的檢測方法，并運用此方法對21款葡萄酒（10款白葡萄酒和11款紅葡萄酒）中的14種農(nóng)藥殘留進行了檢測。結(jié)果顯示，在6款白葡萄酒和6款紅葡萄酒種共發(fā)現(xiàn)了7種農(nóng)藥，濃度是0.8～5 μg/L，其中，83%的含農(nóng)藥葡萄酒樣品中存在農(nóng)藥腐霉利。此外，Ertan等[13]采用商品化65 μm PDMS/DVB萃取頭，建立了固相微萃取與氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測葡萄酒中毒死蜱和甲基毒死蜱的方法，此方法的加標回收率和重現(xiàn)性較好。應(yīng)用此方法，對土耳其3個產(chǎn)區(qū)的葡萄酒進行檢測，毒死蜱和甲基毒死蜱殘留量遠低于歐盟的最大限量。崔宗巖等[14]通過考察富集的目標農(nóng)藥的種類和數(shù)量，選擇了商品化85 μm PA萃取頭，建立了浸入式固相微萃取與氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測葡萄酒中農(nóng)藥殘留的方法，此方法可以準確篩查檢測94種農(nóng)藥殘留，運用此方法，對市場上的327個葡萄酒樣品進行檢測，結(jié)果顯示，在232個葡萄酒樣品中存在至少1種農(nóng)藥殘留。郭亞蕓等[15]采用商品化的85 μm PA萃取頭，以浸入式固相微萃取為前處理方法，氣相色譜-質(zhì)譜為檢測手段，建立了葡萄酒中三唑類殺菌劑殘留的檢測方法，該方法有較高的準確度和良好的穩(wěn)定性，可用于葡萄酒中戊菌唑、氟硅唑、烯唑醇和苯醚甲環(huán)唑的殘留檢測。Manuela等[16]采用商品化的100 μm PDMS萃取頭，建立了固相微萃取與氣相色譜聯(lián)用檢測葡萄酒中農(nóng)藥殘留的方法，運用此方法，對葡萄牙南部的10款白葡萄酒和15款紅葡萄酒進行檢測。胡媛等[17]采用溶膠-凝膠包埋技術(shù)，自主研發(fā)了耐高溫涂層聚二甲基硅氧烷，涂覆于石英纖維表面作為萃取頭，用該萃取頭進行固相微萃取試驗，與氣相色譜儀（配備熱離子化檢測器）聯(lián)用，建立了測定紅葡萄酒中有機磷農(nóng)藥殘留的方法，并運用此方法對紅葡萄酒中久效磷、樂果等12種有機磷農(nóng)藥殘留進行了測定，結(jié)果顯示紅葡萄酒中存在樂果殘留，濃度為0.05 mg/L。Pang等[18]采用溶膠-凝膠技術(shù)，自主研發(fā)了離子凝膠基離子液體([C16MIM][NTf2])，涂覆于石英纖維表面作為萃取頭，該萃取頭具有萃取能力強和使用壽命長等優(yōu)點，以此萃取頭進行頂空固相微萃取試驗，與氣相色譜儀（配備火焰光度檢測器）聯(lián)用，建立了固相微萃取與氣相色譜聯(lián)用檢測葡萄酒中有機磷農(nóng)藥殘留的方法，該方法的檢出限和方法的定量限明顯低于其他現(xiàn)有方法，并運用此方法對2款紅葡萄酒和1款白葡萄酒中甲拌磷、對硫磷、甲基對硫磷和馬拉硫磷4種有機磷農(nóng)藥進行了添加回收試驗，效果良好。由于商品化的萃取頭價格昂貴，葡萄酒中的天然色素，尤其是紅葡萄酒中的天然色素容易污染萃取頭，導(dǎo)致萃取頭壽命縮短，檢驗成本提高，因此，科研工作者的興趣逐漸從購買商品化萃取頭向自主研發(fā)萃取頭方向上轉(zhuǎn)變，固相萃取頭的研發(fā)成為今后研究的熱點和難點。

1.4 基質(zhì)固相分散萃取法（matrix solid phase dispersion, MSPD）

基質(zhì)固相分散萃取是1989年Barker等[19]發(fā)明的一種新型樣品前處理技術(shù)。朱學(xué)良等[20]采用Florisil硅土作為吸附劑，建立了基質(zhì)固相分散與氣相色譜（配電子捕獲檢測器）聯(lián)用檢測葡萄酒中五氯苯、β-六六六、五氯苯胺、甲基五氯苯基硫醚、腐霉利等5種農(nóng)藥殘留的方法，并對空白酒樣進行了添加回收試驗，效果良好。Zhu等[21]采用乙腈萃取，F(xiàn)lorisil硅土作為吸附劑，建立了固相分散萃取與氣相色譜聯(lián)用（配電子捕獲檢測器）測定葡萄酒中腐霉利等3種農(nóng)藥殘留量的方法，應(yīng)用此方法，對市售的不同品牌紅葡萄酒、桃紅葡萄酒和白葡萄酒進行檢測，未發(fā)現(xiàn)農(nóng)藥殘留。MSPD法填補了溶液提取固體和半固體樣品的空白，試驗過程中無需進行組織勻漿、沉淀、離心、pH調(diào)節(jié)和樣品轉(zhuǎn)移等操作步驟，操作簡單，避免了樣品損失，減小了試驗誤差，此外，該方法還具有分析速度快、有毒有害溶劑用量少等優(yōu)點。缺點是目前沒有實現(xiàn)自動化，試驗操作需手動，因此，自動化研究成為今后研究的熱點和難點[22]。

1.5 分散固相萃取法（disperse solid phase extraction, dSPE）

分散固相萃取又稱QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）萃取，是2003年由美國農(nóng)業(yè)部Anastassiades等開發(fā)出來的一種快速的農(nóng)產(chǎn)品檢測樣品前處理技術(shù)。陳楠楠等[23]采用乙腈萃取，PSA/GCB/ODS作為吸附劑，建立了分散固相萃取GC-MS法快速測定葡萄酒中22種農(nóng)藥殘留的方法，采用本方法對不同產(chǎn)地葡萄酒樣品進行檢測，其中1個葡萄酒樣品被檢出甲霜靈殘留，殘留量為0.08 mg/kg。謝建軍等[24]采用乙腈快速提取，GCB、NH2和PSA作為吸附劑，建立了固相分散萃取與氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測定葡萄酒中43種農(nóng)藥殘留量的方法，應(yīng)用此方法，對20個來自不同國家和國內(nèi)不同地區(qū)的葡萄酒樣進行檢測，結(jié)果在9個葡萄酒樣中發(fā)現(xiàn)農(nóng)藥殘留。吳鳳琪等[25]采用乙腈提取，PSA、C18和GCB作為吸附劑，建立了分散固相萃取-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測葡萄酒中嘧霉胺、腐霉利等56種農(nóng)藥殘留的方法，并對空白酒樣進行了添加回收試驗，效果良好。利用酸化乙腈提取，N-丙基乙二胺、石墨化碳黑和C18粉末作為吸附劑，建立了基質(zhì)固相分散萃取與氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用同時測定葡萄酒中16種有機磷類和有機氯類農(nóng)藥殘留的方法[26]。按試驗方法對紅葡萄酒、桃紅葡萄酒和白葡萄酒樣品進行了檢測，結(jié)果顯示，白葡萄酒、桃紅葡萄酒和紅葡萄酒中各發(fā)現(xiàn)了8種農(nóng)藥殘留。分散固相萃取法具有操作簡單、耗時短、回收率高等優(yōu)點，但對于茶葉、高脂產(chǎn)品等具有復(fù)雜基質(zhì)的樣品仍有一定局限性[22]。分散固相萃取試驗中，吸附劑的選擇尤為重要，近年來，科研工作者的研究方向逐漸向新型吸附劑材料的研發(fā)上發(fā)展。

1.6 分散液液微萃取法（dispersive liquid-liquid microextraction，DLLME）

分散液液微萃取技術(shù)是2006年Rezaee等[27]提出的一種新型的液相微萃取技術(shù)，它具有操作簡單、有毒有害溶劑用量少和富集倍數(shù)高等優(yōu)點。Chen等[28]以氯仿為萃取劑，乙腈為分散劑，建立了分散液液微萃取與氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測葡萄酒中27種常見禁限用農(nóng)藥殘留的方法。運用該方法對10款進口葡萄酒（5款紅葡萄酒、5款白葡萄酒）進行檢測，其中9款葡萄酒中檢出甲霜靈、腈菌唑等5種農(nóng)藥，而甲霜靈濃度最高，達18.6 μg/L。郭亞蕓等[29]以十一醇為萃取劑，超聲輔助萃取，建立了分散液液微萃取與氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用檢測葡萄酒中三唑類農(nóng)藥殘留的分析方法，運用該方法對市售的5款葡萄酒中戊菌唑、氟硅唑、烯唑醇和苯醚甲環(huán)唑的殘留量進行了測定。Chu等[30]以正辛醇為萃取劑，上下振動輔助，建立了分散液液微萃取與氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測葡萄酒中殺菌劑殘留的方法。運用此方法對1款紅葡萄酒和1款白葡萄酒中嘧菌環(huán)胺、腐霉利等6種殺菌劑進行檢測，結(jié)果顯示，紅、白葡萄酒均未被污染。添加回收試驗，效果良好。Rodríguez-Cabo等[31]以十一醇為萃取劑，建立了分散液液微萃取與氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測葡萄酒中殺菌劑殘留的方法，以西班牙西北部超市購買的5款紅葡萄酒和7款白葡萄酒為樣品，評估了該方法測定真實葡萄酒中殺菌劑的有效性，效果良好。Wang等[32]以離子液體（HMIMPF6）為萃取劑，超聲輔助，建立了分散液液微萃取與高效液相色譜聯(lián)用測定紅葡萄酒中殺菌劑殘留的方法，以豐收和長城兩個品牌的紅葡萄酒為試樣，驗證該方法的適用性。結(jié)果表明，兩個品牌的紅葡萄酒均未受到嘧霉胺等7種殺菌劑污染。Timofeeva等[33]將二氯甲烷和己醇的混合物添加到葡萄酒樣中，葡萄糖作為引發(fā)劑，加熱后二氯甲烷揮發(fā)，己醇浮于樣品頂部，分離后進樣檢測，建立了分散液液微萃取與液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測葡萄酒中殺蟲劑殘留的方法，并用此方法檢測了3款白葡萄酒和1款紅葡萄酒中馬拉硫磷、二嗪農(nóng)和伏殺磷的殘留量。結(jié)果顯示，在1個白葡萄酒樣品中發(fā)現(xiàn)了二嗪農(nóng)殘留。分散液液微萃取試驗中有毒有害的分散劑正逐步被表面活性劑或超聲等輔助形式所取代，萃取劑的選擇也尤為重要，傳統(tǒng)的萃取劑（有機溶劑）具有毒性大，且不適用于復(fù)雜基質(zhì)的樣品等特點，因此，適用于復(fù)雜基質(zhì)的綠色環(huán)保型萃取劑的合成成為今后研究的熱點和難點。

2 葡萄酒中有機磷農(nóng)藥殘留檢測前處理方法

有機磷農(nóng)藥是我國現(xiàn)階段使用量最大的農(nóng)藥，品種和用量居各類農(nóng)藥之首[34]。葡萄酒中有機磷農(nóng)藥殘留檢測前處理方法主要有：液液萃取法[35]、固相萃取法[27]、固相微萃取法[28,31]、基質(zhì)固相分散萃取法[36]。液液萃取法、固相萃取法和基質(zhì)固相分散萃取法試驗過程中需采用易揮發(fā)的有毒有機溶劑，對人體和環(huán)境存在威脅。固相微萃取法不使用有機溶劑，是集富集、凈化、進樣于一體的綠色環(huán)保型前處理方法，但是，試驗中萃取頭價格昂貴，易損壞。因此，適用于葡萄酒，尤其是紅葡萄酒基質(zhì)的綠色環(huán)保型前處理方法的研究成為今后研究的熱點和難點。

3 結(jié)論

樣品前處理技術(shù)是葡萄酒農(nóng)藥殘留檢測試驗過程的關(guān)鍵，本文對國內(nèi)外葡萄酒中農(nóng)藥殘留檢測方法中的前處理方法進行了綜述，主要包括液液萃取法、固相萃取法、固相微萃取法、基質(zhì)固相分散萃取法、分散固相萃取法和分散液液微萃取法，并對各方法的優(yōu)缺點及應(yīng)用前景進行了闡述。實現(xiàn)前處理過程的自動化，提高工作效率，減少試驗過程中有毒有害溶劑的使用，降低檢驗成本，是目前葡萄酒農(nóng)藥殘留檢測試驗中亟待解決的問題。