針刺對腦缺血再灌注損傷神經細胞自噬影響的研究概況

孫曉偉，高營，王新宇，劉婷婷，潘婷婷，劉丹，劉勇，陳英華，金弘，李洪濤*

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040)

腦缺血再灌注損傷[1](Cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)是急性腦梗死再通后常見的病理過程，CIRI后會引發一系列的損傷級聯反應，最終導致大量神經細胞損傷或死亡。自噬(autophagy)作為新發現的程序性細胞死亡方式，對于腦缺血再灌注后神經細胞的“存活”與“毀滅”意義重大。一方面適度自噬可幫助細胞清除受損的細胞器和異常折疊蛋白，促進自體修復，從而對神經細胞損傷發揮保護作用；另一方面過度的自噬與凋亡信號存在交互作用，可誘導自噬性細胞死亡、促進細胞凋亡的發生與發展，從而加重神經細胞損傷。因此，明確CIRI后神經細胞自噬的調控機制，通過某些干預手段，促使CIRI后神經細胞自噬的適度激活，進而保護神經細胞、促進神經細胞的自體修復，有望成為CIRI后神經功能重塑的新的治療思路。

針刺作為中醫學的特色療法，在CIRI防治過程中顯示出獨特的優勢，其穩定和理想的療效，安全方便的操作已受到了醫學界的公認和肯定。對機體可發揮多環節、多水平、多途徑的調節作用。越來越多的研究表明針刺對CIRI后誘導的神經細胞自噬有良性的調節作用。本文就國內外關于針刺對CIRI誘導神經細胞自噬影響的相關文獻進行綜述，以期為臨床應用針刺防治CIRI提供全新的科學依據。

1 自噬概述

自噬[2]又稱細胞的“自我消化”，是一種細胞經由溶酶體途徑參與降解胞漿內受損的細胞器和大分子物質的分解代謝過程，對維持細胞的生存、分化、生長以及穩定具有重要作用[3]。根據自噬的轉運方式可分為巨自噬、微自噬以及分子伴侶介導的自噬[4]；根據自噬對降解底物的選擇性可分為選擇性自噬(線粒體自噬、內質網自噬、過氧化物酶體自噬、核糖體自噬和脂類自噬)以及非選擇性自噬[5]。

目前常采用透射電鏡、微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associatedprotein 1 light chain 3，LC3/Atg8)turnover、綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)的抗降解性、P62蛋白、mRFP-GFP-LC3活細胞成像和流式細胞儀等方法檢測自噬體及其標志蛋白[6]。透射電鏡是觀察自噬最直接、最經典的方法，能特征性地表現為細胞質中有自噬體和自噬溶酶體出現[7]。自噬[8]是一個由自噬相關蛋白精密調控的、動態的生物進程，基本過程包括誘導、隔離膜生成與延伸、自噬體的形成與成熟、與溶酶體融合、自噬溶酶體的降解以及小分子循環再利用等步驟，這一過程對細胞清除廢物、結構重建起關鍵作用。

2 自噬與腦缺血再灌注損傷

近年來，大量體外或在體的實驗證明自噬參與了腦缺血再灌注損傷的病理過程，并且影響神經細胞的生存和死亡。Sheng等[9]分別通過自噬誘導劑雷帕霉素及自噬抑制劑3-MA對大腦中動脈阻塞引起的缺血性腦損傷大鼠模型進行預處理和預適應后，觀察到缺血大鼠模型的腦梗塞面積、腦水腫程度以及神經功能缺陷三個方面均有不同程度減輕，進而說明自噬對缺血性腦損傷的神經細胞具有保護作用。Carloni等[10]研究也發現在缺血缺氧誘導的腦損傷時神經細胞自噬水平增加，自噬誘導劑雷帕霉素進一步上調自噬水平后可減少壞死性細胞死亡，減輕腦損傷。但也有實驗證明，過度的自噬可以誘導神經細胞死亡。CHEN等[11]發現，在特定的環境下，自噬不僅阻止細胞死亡同樣也調節細胞死亡，如果自噬破壞細胞質或者細胞器超過一定的閾值，自噬性細胞死亡就會發生。大鼠進行永久大腦動脈栓塞造模，可引起自噬的過度激活，導致自噬性細胞死亡，加重了腦損傷，分別用3-MA抑制自噬和干擾Beclin 1均可減輕大鼠的神經元死亡。因此，在腦缺血/再灌注不同時間窗，通過何種途徑啟動自噬，發揮其清除作用，又通過何種途徑關閉自噬來防止其過度激活，決定著自噬是發揮保護抑或損傷作用，對其相關的分子機制的研究有望為今后該病的防治提供重要的干預靶點[12]。

3 針刺對CIRI神經細胞自噬影響的研究概況

隨著現代醫學的不斷發展，國內外在針刺防治CIRI的臨床機制與動物實驗研究方面取得了長足進步，從宏觀到微觀、從系統水平到基因水平均有所涉及。許多研究資料證實[13-15],針刺可增強腦組織超氧化物歧化酶活性；對抗自由基損傷；抑制興奮性氨基酸釋放；減輕免疫炎性反應；降低Ca2+超載；改善腦部血液循環、增加血流量、促進腦微血管功能重建及血腦屏障修復；抑制神經細胞凋亡；促進內源性神經營養因子、神經生長因子的激活與神經干細胞增殖；調控細胞間信號轉導等。針刺拮抗CIRI的機制是多方面、多層次的，針刺幾乎參與了CIRI的所有病理變化過程，而CIRI后的各種分子學改變是相互影響、相互制約的，針刺正是通過調節這樣一個錯綜復雜的系統而達到減輕CIRI、保護神經細胞的作用。近年來隨著對自噬研究的不斷深入，大量的實驗研究亦表明[16-17]，針刺對CIRI誘導的神經細胞自噬有一定的調控作用。

3.1 針刺對CIRI神經細胞自噬相關蛋白表達的影響

自噬有著相當復雜的分子調控機制，其中Atg6(Beclin-1)、Atg8(LC3)和P62蛋白是自噬發生必不可少的分子[18]。LC3是酵母自噬相關基因Atg8的哺乳動物同源類似物，存在兩種可以互相轉換的形式,分別為LC3-Ⅱ和LC3-I[19]。LC3-Ⅱ被認為是自噬體形成的標志，與自噬體的形成有著密切的關系，隨著自噬體膜的不斷增多，LC3-Ⅱ的數量或LC3-Ⅱ/I的比例與自噬體的數量呈正比，在一定程度上反應了自噬的活性[20]。缺血性卒中后3 h，RT-PCR和Western Blot等技術便可檢測到LC3的表達[21]。Beclin-1作為酵母Atg6的同源物，與三類磷酸肌醇3-激酶(class III phosphoinositide 3-kinase，PI3K)和Atg14L等結合形成復合體，調控自噬前體和自噬體形成[22]。Beclin-1在大鼠腦內如皮質、海馬、小腦等均有表達，免疫組化等方法在腦組織缺血后6 h即發現Beclin-1陽性細胞，24 h達高峰，至少持續48 h[23]。干擾Beclin-1表達可降低腦缺血誘導的自噬激活[24]。P62蛋白是一種支架蛋白，作為一種自噬特異性底物，偶聯于LC3，通過自噬小體與溶酶體完成蛋白的降解[25]，在體內P62蛋白與自噬水平呈負相關，在大鼠局灶性腦缺血模型建立后6 h，該蛋白表達下調，持續至少48 h，在缺血后24 h達最低點。徐勤紅等[26]通過隨機對照的臨床研究，觀察“通督調神針法”與常規針刺治療急性腦梗死患者的臨床療效差異及其與自噬的關系，結果發現“通督調神針法能明顯提高急性腦梗死患者血清中LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白的表達，促進自噬溶酶體形成，促使細胞自噬的大量啟動，最終減輕CIRI，發揮神經保護作用，從而提高患者生活質量、智力水平及改善神經功能。馮曉東等[27]通過制備MCAO/R大鼠模型，觀察電針神庭、百會穴對MCAO大鼠學習記憶能力、腦梗死體積以及Beclin-1表達的影響，結果發現電針神庭、百會穴可使MCAO/R大鼠逃離水迷宮的潛伏期明顯縮短，可明顯改善其學習記憶障礙，同時自噬相關基因Beclin-1與其蛋白表達均上調，提示電針對自噬水平的提高可能是其改善卒中后認知功能的機制之一。Ting Z等[28]通過血管閉塞建立腦缺血再灌注大鼠模型，電針百會、神門和足三里穴后，通過Western印跡法測量自噬相關蛋白LC3，mTOR和Beclin-1的表達情況以及TTC染色評估大鼠腦梗死面積，發現給予電針刺激后的大鼠的LC3和Beclin-1水平降低，mTOR水平升高。由此證明電針干預不僅可以減輕腦缺血引起的氧化和炎癥損傷，同時可以通過抑制神經元的過度自噬改善CIRI。Shu S等[29]采用隨機對照實驗，給予腦缺血再灌注模型電針刺激，在不同時間下測量大鼠的神經功能缺損和腦梗死體積以評估改善效果，同時檢測Beclin-1和LC3-Ⅱ的表達以探討電針對自噬的影響，結果顯示電針可顯著降低神經功能缺損評分和腦梗死體積，電針組中Beclin-1，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例顯著降低，說明自噬可能是參與電針腦缺血再灌注損傷的關鍵機制之一。

3.2 從mTOR通路研究針刺對CIRI神經細胞自噬的影響

自噬的調節除了由多種分子參與外，還涉及了多條信號通路[30]，其中雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路是調節自噬的最主要信號通路。mTOR的上游涉及到PI3K/Akt、MAPK(ERK、JNK、p38MAPK)、AMPK(LKB1-AMPK)等多條信號通路。哺乳類動物體內唯一的mTOR是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，按功能可分為mTORC1和mTORC2，其中mTORC1主要調節自噬和蛋白質合成[31]。研究表明[32]，缺血缺氧刺激，通過ATP/AMP比值的降低來調控AMPK通路，抑制mTORC1活性進而誘導自噬。Carloni等[33]對SD大鼠缺血缺氧性腦損傷前側腦室注射自噬誘導劑雷帕霉素、PI3K抑制劑渥曼青霉素、自噬抑制劑3-MA后，發現PI3K-Akt-mTOR自噬信號通路參與了缺血缺氧造成的損傷。Ⅲ型PI3K是細胞內一種能通過催化底物形成PI3P的關鍵酶，誘導自噬的產生，抑制細胞的凋亡和壞死，對細胞有保護作用。有研究者[34]通過給予缺血缺氧腦病大鼠的電針干預治療，觀察到電針對PI3K/Ak信號轉導通路及下游靶蛋白mTOR具有調控作用，證實PI3K/Akt信號轉導通路與缺血缺氧腦病的保護機制密切相關。何堅等[35]通過電針針刺MCAO/R模型大鼠曲池、足三里，并在電鏡下觀察發現，電針組mTORC1的表達比模型組提高，LC3-Ⅱ/LC3-I的比率卻比模型組低，提示電針可抑制自噬溶酶體數量，說明電針可能通過mTORC1-ULK復合體-Beclin1通路抑制過度激活的細胞自噬，從而保護神經元。

3.3 從內質網應激途徑研究針刺對CIRI神經細胞自噬的影響

內質網(Endoplasmic reticulum，ER)對膜蛋白的合成、初始翻譯的修飾以及蛋白的正確折疊和分泌具有關鍵作用。腦缺血再灌注損傷后會破壞內質網功能，使得蛋白折疊受阻，大量未折疊或錯誤折疊蛋白蓄積于內，誘發內質網應激(Endoplasmic reticulum stress, ERS)[36]，激活未折疊蛋白反應(Unfolded protein response, UPR)，增加伴侶分子的合成及錯誤折疊或未折疊蛋白質的降解來維持內質網的穩態平衡。當ERS激活時會進一步引發細胞自噬，以清除錯誤折疊蛋白，恢復內質網穩態；內質網內環境的平衡又反過來抑制ERS，減少細胞凋亡，促進細胞生存。由此，ERS與自噬的適度激活形成了機體內適應性、保護性的交互作用[37]。UPR是誘導細胞自噬的重要信號通路。UPR信號通路被激活后，內質網內的未折疊蛋白使得葡萄糖調節蛋白78(Glucose-regulated protein78/Binding immuno-globulin protein，GRP78/Bip)釋放PERK/elF2α、Ire1/TRAF2、ATF6α，共同調控下游CHOP，而CHOP轉錄調控抑制抗凋亡蛋白Bcl-2，最終通過誘導自噬相關蛋白Beclin-1表達來影響自噬。舒適[38]在MCAO/R大鼠模型中，通過動態觀察針刺水溝穴對CIRI后內質網應激UPR信號轉導通路誘導自噬性程序性細胞死亡的影響，從內質網應激UPR三條信號轉導通路PERK/el F2α、Ire1/TRAF2、ATF6α的分子作用途徑深入闡釋CIRI后自噬性程序性細胞死亡的作用機制以及針刺水溝穴減輕CIRI可能物質基礎與有效作用靶點，結果發現電針水溝穴對大鼠CIRI的治療作用機制可能與抑制Beclin-1、LC3表達，下調神經細胞自噬水平密切相關；電針水溝穴可能通過上調GRP78，干預UPR中PERK/e IF2α和IRE1通路，抑制CHOP表達水平來影響內質網應激；內質網應激CHOP通路調控Beclin-1表達，抑制過度自噬是針刺水溝穴減輕CIRI的重要環節；并由此推測針刺減輕發生CIRI可能與啟動內質網應激UPR三條信號轉導通路調控CHOP來誘導細胞自噬過程密切相關。

4 總結與展望

總之，細胞自噬是一把“雙刃劍”，可廣泛參與CIRI復雜的病理生理進程，影響細胞的存活與死亡。一方面適度自噬可幫助細胞恢復內環境的穩態，促進細胞自體修復，從而對神經細胞損傷發揮保護作用；另一方面過度自噬又可誘導自噬性細胞死亡、促進凋亡的發生與發展，從而加重神經細胞損傷，因此，探究CIRI后神經細胞自噬及其相關機制，具有重要的研究價值和科學研究意義。

針刺對CIRI后神經細胞自噬的研究剛剛起步，雖然我們已經對國內外文獻進行了全面的檢索，但有關此方面研究的文章總數還是相對較少，穴位選擇、針灸干預措施等均缺乏重復測試，且多數為動物實驗，僅有1篇臨床研究。同時許多研究多針對CIRI后自噬相關蛋白展開研究，對自噬的通路、選擇性自噬(內質網自噬、線粒體自噬、過氧化物酶體自噬)等研究相對較少。另外，采用的研究方法相對單一，多為透射電鏡、Western Blot和RT-PCR等檢測方法。實驗設計上尚有很多不足，如缺乏特異性抑制劑、慢病毒干擾以及相關基因敲除等作為特異性對照；同時大多研究沒有設立假針刺組和非穴位組等。相信隨著針刺調控CIRI后細胞自噬嚴謹規范和更加細微深入的系統研究，針刺對CIRI后神經細胞的調控機制會更加明朗化，從而為缺血性腦卒中及腦缺血再灌注損傷的防治取得突破性的進展奠定堅實的基礎。