食品中金剛烷胺類化合物檢測方法的研究

□ 熊 雯 易路遙 吉偉佳 章 紅 江西省藥品檢驗檢測研究院 江西省藥品與醫療器械質量工程技術研究中心

金剛烷胺、金剛乙胺、美金剛胺是母體結構為飽和環癸烷的金剛烷胺類化合物。金剛烷胺、金剛乙胺都是FDA批準的抗甲型流感病毒的藥物，能在極低濃度下通過M2蛋白質子通道抑制甲型流感病毒的復制[1-3]。美金剛胺是金剛乙胺的同分異構體，作用機理相似。雖然許多國家禁止在家禽養殖中使用金剛烷胺和金剛乙胺[4-5]，但在中國和美國，這類化合物仍被非法用于家禽（尤其是雞）養殖中[6]，原因可能是：①金剛烷胺類化合物價格低廉，抗流感病毒活性好；②農戶為減少在禽流感肆虐流行期間的經濟損失，不顧法律法規定期給禽類喂食藥物；③飼料廠家在產品中添加藥物，從而吹噓該產品具有增強機體抵抗力的功效。金剛烷化合物的濫用，使得耐藥菌株出現，并呈增加的趨勢[7]。

在我國，獸藥已從傳統線下營銷模式慢慢轉向互聯網營銷模式，2019年9月，在“某”寶、“某”多多、“某”巴巴等APP上搜索“金剛烷胺獸用”“金剛乙胺獸用”，發現不少商家銷售金剛烷胺類化合物。同時，還有部分商家宣傳金剛烷胺類化合物具有預防和治療畜禽及家禽流感病毒的功效。鑒于金剛烷胺類化合物在我國的濫用情況，本文對近年來金剛烷胺類化合物的檢測方法進行綜述，希望為監管檢驗研究人員提供參考和借鑒。

1 色譜分析法

1.1 高效液相色譜技術

高效液相色譜技術（HPLC)是有機化合物分析運用中最普遍的一種檢測方法。HPLC法的檢測器有紫外檢測器（包括UV、DAD)、電化學檢測器（ECD）。金剛烷胺類化合物是穩定飽和的三環胺化合物，僅吸收小于200 nm的波長輻射，紫外響應極小，需經衍生化才能通過紫外檢測器測定。F.A.L.Van Der Horst等[8]采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）膠束介導，研究了尿中金剛烷胺柱前衍生結合反相高效液相色譜的在線測定方法。在60 ℃和pH為11條件下，金剛烷胺與1-氟-2，4-二硝基苯進行衍生化，4 min內完全轉化為含有色基團的衍生物，從而產生紫外檢測信號。該法檢測金剛烷胺的低限是75 ng/mL。劉益慶等[9]采用蒸發光散色高效液相色譜法測定小兒氨酚烷胺顆粒中鹽酸金剛烷胺的含量，蒸發光散色檢測器是通用質量型檢測器，可以檢測任何有機物質，用于基質干擾小化合物的檢測，對于食品等復雜基質并不適用。

1.2 氣相色譜法

張翠芬等[10]采用甲醇∶三氯乙酸（1∶1）提取飼料中金剛烷胺，經MCX陽離子固相萃取柱凈化，建立檢測金剛烷胺含量的FID氣相色譜外標定量法。飼料中金剛烷胺的添加量一般為100～200 mg/kg，該方法檢出限為1.0 mg/kg，其回收率為76.9%～98.3%，相對標準偏差小于5%，以上參數均符合實驗要求。

1.3 高效液相串聯質譜儀法

高效液相色譜-質譜聯用儀對金剛烷胺類化合物的定性和定量檢測具有較高的準確度。因此，HPLC-MS法成為這類化合物研究分析最主要的方法[11-12]，也是我國法定標準使用的唯一方法。

Dawei Chen等[6]提出一種提取雞肌肉中金剛烷胺、金剛乙胺和美金剛胺的分散微固相萃取法（DMSPE）。試驗以1%酸性乙腈為提取溶劑，磁性陽離子交換聚合物為吸附劑，采用DMSPE凈化技術得到供試品溶液， 經 HSST3（100 mm×2.1 mm i.d.，1.8 μm）色譜柱分離，UHPLCHRMS測定金剛烷類藥物的含量。結果表明，DMSPE方法簡便、有效，適用于雞肌肉中金剛烷類藥物的提取，提取時間相對較短。Yinliang Wu等[13]以d15-金剛烷胺、d4-金剛乙胺-、d6-美金剛胺為內標，采用多壁碳納米管（MWCNTs）作為反相分散固相萃取（r-dSPE）材料，結合超高液相色譜串聯質譜儀，建立同時測定雞肌肉中金剛烷胺、金剛乙胺和美金剛胺含量的方法。在最佳優化條件下，雞肌肉中3種藥物的回收率為96.8%～104.6%，變異系數（CV）為3.8%～6.4%。

1.4 氣相色譜串聯質譜法

N Narasimhachari等[14]采 用 兩步法從生物樣品中提取金剛烷胺，經二硫化碳處理，轉化為其異硫氰酸酯（NCS）衍生物，以苯丙胺為內標物，再以NCS-金剛烷胺進行定量。

2 酶免疫法

2.1 酶聯免疫吸附法（ELISA）

酶聯免疫吸附法是一種由吸附底物、免疫識別和酶標組成的免疫檢測方法。其優點是前處理快捷方便、儀器便宜易操作；缺點是靈敏度和準確度較低。該法在食品農藥殘留、真菌毒素、獸藥殘留中廣泛運用，近年來在食品安全性快檢技術中成為發展熱點。

Dapeng Peng等[15]致力于研發一種對金剛烷胺類化合物具有高親和力的單克隆抗體（mAb)，該抗體對AMA（半抑制濃度為100%）和RIM（半抑制濃度為70.6%）具有交叉反應活性，并通過ELISA法檢測可食用雞組織中金剛烷胺和金剛乙胺，金剛烷胺和金剛乙胺的檢出限均達5.1、5.5 μg/kg。實驗喂養20批陽性雞樣品，同時采用酶聯免疫吸附法（ELISA）和高效液相色譜-質譜法（HPLC-MS）檢測，發現ic-ELISA與HPLC-MS的結果具有良好相關性。

譚庶等[16]合成出可特異性識別金剛烷胺的單克隆抗體，采用間接競爭酶聯免疫吸附分析法測定雞肉基質中金剛烷胺的含量。實驗發現，金剛烷胺與結構和功能類似物的交叉反應率均小于0.01%，但與金剛乙胺交叉反應率為29.89%，其在0.07～6.15 μg/L線性良好，檢出限為0.21 μg/L，雞肉樣品中添加回收率為101.69%～108.71%，變異系數低于10.57%。

2.2 化學發光免疫分析法（CLEIA）

化學發光免疫分析法（CLEIA）是將化學發光法（CL）與酶聯免疫吸附法（ELISA）技術相結合，具有化學發光反應的高靈敏度與免疫反應的高特異性兩種優點[17]。近年來，CLEIA被廣泛應用于多種食品痕量分析領域[18-19]。

崔廷婷等[20]以AMD單克隆抗體與磁珠偶聯形成AMD磁標抗體，魯米諾+對羥基聯苯+過氧化氫作為發光物質，建立動物組織、獸藥、飼料中金剛烷胺殘留化學發光酶免疫分析方法。該方法的半抑制濃度為0.481 μg/L，在3種基質樣本中的檢測限為0.1 μg/kg，添加回收率在80.2%～94.5%。金剛烷胺的印跡因子達到2.33，金剛乙胺、美金剛胺、曲金剛胺3個結構類似物的選擇性因子達到6.20、5.29和3.95。

3 分子印跡電化學傳感器技術

分子印跡技術是基于免疫原理發展形成的一種新興分子識別技術。傳感器的分子印跡聚合物與基質樣品中的目標化合物會發生識別作用，從而產生一些物理學信號（電極、電阻等）變化，通過效應器轉換成可測信號，以檢測目標化合物；合成的分子印跡聚合物代替生物受體作為傳感器的識別元件逐漸成為許多研究的重點[21]。

Yaguang Yun等[22]以金剛烷胺作為模板分子，鄰氨基苯硫酚為功能單體，通過電沉積技術在金電極表面聚合形成聚鄰氨基苯硫酚聚合物膜，研制了一種用于動物源性食品中金剛烷胺殘留檢測的新型分子印跡聚合物電化學傳感器。為使分子印跡傳感器的性能達到最佳，優化了模板/單體比、CV掃描循環數、浸漬時間等系列參數。實驗表明，金剛烷胺的印跡因子達到2.33，金剛乙胺、美金剛胺、曲金剛胺3個結構類似物的選擇性因子分別達到6.20、5.29和3.95。該方法與典型的高效液相色譜-串聯質譜聯用方法所得結果一致，具有較高的相關系數（R2＞0.99）。

4 熒光探針技術

熒光探針技術是針對不具備熒光或者弱熒光特性的化合物，用間接法來進行熒光檢測的一種技術。金剛烷胺、金剛乙胺是三環癸烷化合物，沒有天然熒光，常規熒光法無法直接測定，大量文獻報道熒光光譜利用熒光探針技術測定其含量[23-25]。

4.1 超分子包合物探針

具有一定尺寸空腔的超分子環糊精、杯芳烴、葫蘆脲等主體分子和客體分子（熒光指示劑）以分子間弱相互作用（靜電相互作用、氫鍵、范德華力等）在溶劑體系形成穩定的化合物，待測化合物通過與熒光指示劑競爭空腔，引起熒光強度的改變來進行含量測定[26]。Guangquan Wang等[,25]以黃連堿-葫蘆[7]脲為熒光探針體系測定藥品制劑和尿液中金剛烷胺和金剛乙胺含量，線性范圍在0.004 0～1.0 μg/mL，通過熒光光譜法、核磁共振氫譜和分子模型計算，研究了兩種藥物與黃連堿競爭葫蘆[7]脲空腔的超分子相互作用機制。朱林照等[,26]合成了一種熒光指示劑ABAM，它和葫蘆[7]脲構建成新的熒光探針體系，對金剛烷胺有較好的特異性、同時抗干擾性強，其結合常數為8.7×10-8M-1，金剛烷胺化合物在0.000 188～0.375 μg/mL范圍內線性關系良好，最低檢測濃度為6.5×10μ5μg/mL。該熒光探針系統對藥物及動物肉類等樣品中金剛烷胺濃度的檢測具有重要意義。本研究利用內過濾效應（IFE）將CDs引入酶聯免疫吸附試驗（ELISA）系統，研制了一種新型熒光酶聯免疫吸附試驗方法。

4.2 碳點探針

碳點是指三維空間尺寸均在1～10 nm的零維度碳納米晶體[27]。近兩年，碳點因其光致發光特性，較高的熒光穩定性，良好的生物相容性，在食品安全檢測領域展現廣泛的應用前景[28]。

Baolei Dong等[29]以碳點（CDs）和MnO2納米片（NSs）的納米組裝物為熒光探針，建立一種熒光酶聯免疫吸附法用于檢測食品中金剛烷胺，碳點（CDs）作為熒光底物，MnO2納米片為熒光淬滅劑及識別單元，形成p-CDs@MnO2NSs的探針體系。2-磷酸抗壞血酸經抗體標記的堿性磷酸酶（ALP）催化，水解生成抗壞血酸，其能分解納米組裝物，使CDs游離從而恢復熒光。熒光強度的變化與溶液中金剛烷胺的濃度有關，該法線性范圍為0.048～1.1 ng/mL，檢測限（LOD）為0.035 ng/mL。

5 結語

高效液相色譜串聯質譜法是測定食品中金剛烷胺類化合物最經典的分析方法，具有高選擇性、高靈敏度、高準確度和無需衍生等優點，且常被用于評估其他檢驗方法的優劣。近年來，各種仿生抗體、超分子和納米晶體成功制備，并運用于金剛烷胺類化合物含量測定，這類方法屬于分子識別技術，但文獻鮮有報道相似結構化合物是否存在干擾，這一系列方法操作較為簡便，為金剛烷胺化合物的檢測提供了良好的思路，將來也必是檢測技術發展的新方向。