一例調(diào)入豬肉非洲豬瘟病毒檢測

毛懷志 張艷紅 康建生

（1，山西省動物疫病預(yù)防控制中心 030027；2，山西省畜牧遺傳育種中心 030027）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒引起的豬的一種急性、熱性、高度傳染性疾病。該病病程短，死亡率高，對養(yǎng)豬業(yè)危害甚大，有著重要的社會經(jīng)濟(jì)學(xué)意義，2018 年8 月3 日我國非洲豬瘟疫情在遼寧首發(fā)，之后在多個省份相繼發(fā)生。特別是2018 年10 月在山西省發(fā)生以來，由于對病豬和感染豬的撲殺，加之豬后續(xù)生產(chǎn)力不足，大幅度降低了豬肉產(chǎn)品的供應(yīng)能力，造成豬肉價格持續(xù)上漲，人民生活消費上漲，引發(fā)一系列社會深層次問題。

為穩(wěn)定市場供應(yīng)，保證人民生活，確實做好山西省非洲豬瘟防控工作，山西省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳、公安廳等多部門積極配合進(jìn)行非洲豬瘟防控，2019 年9 月山西省市場監(jiān)督管理局下達(dá)2019 年加工流通環(huán)節(jié)非洲豬瘟病毒檢測任務(wù)。山西省食品藥品檢驗所對平遙縣某有限公司外購生豬產(chǎn)品進(jìn)行了非洲豬瘟抽樣檢測，9 月28 日，在抽檢的兩批共10 份豬肝樣品中均檢出非洲豬瘟疑似陽性。9 月29 日，經(jīng)山西省動物疫病預(yù)防控制中心實驗室檢測確認(rèn)為非洲豬瘟陽性。

1 材料

1.1 樣品

樣品來源：2019 年9 月19 日，根據(jù)山西省市場監(jiān)督管理局下達(dá)2019 年加工流通環(huán)節(jié)非洲豬瘟病毒檢測任務(wù)中，山西省食品藥品檢驗所對平遙縣某有限公司外購生豬產(chǎn)品進(jìn)行非洲豬瘟抽樣檢測，9 月28 日，在抽檢的兩批共10 份豬肝樣品中均檢出非洲豬瘟疑似陽性。

1.2 儀器設(shè)備

寧波新芝48 位高通量組織研磨儀，美國精騏有限公司SY-1220 型恒溫水浴槽，美國 Thermo 公司 Biofugestratos 型臺式高速冷凍離心機(jī)，美國ABI 公司700 型24 孔全自動核酸提取儀，QuantStudio 7 實時熒光定量PCR 儀。

1.3 試劑

廣州維伯鑫病毒總核酸提取試劑盒（磁珠法），批號2019032801；洛陽萊普生信息科技有限公司非洲豬瘟病毒實時熒光PCR 檢測試劑盒說明書，批號P190434。

2 檢測方法

2.1 樣品處理

操作步驟：

（1）根據(jù)待檢組織數(shù)量取n 個已加入1ml 的高壓滅菌PBS（0.01M，pH7.2～7.4）或生理鹽水無菌無 RNase 的 EP 管（n=待檢樣品數(shù)量，已加入滅菌鋼珠）。

（2）每份組織分別從3 個不同的位置剪綠豆大小的組織，放入EP 管中密封，并進(jìn)行標(biāo)記，表面消毒備用。

（3）每取一個組織塊，用2%～5%次氯酸鈉溶液浸泡消毒剪鑷等取樣器械。

（4）組織樣品的破碎利用組織研磨儀在生物安全柜外操作，使用高通量組織研磨儀進(jìn)行研磨，參數(shù)為70Hz，120s，研磨2 次，將樣品制成組織勻漿懸液。

（5）將研磨完成的組織勻漿置于60℃水浴中，滅活20～30min。

（6）滅活完成后，如果可吸取上清液，則無須進(jìn)行離心處理；如無法順利吸取上清液，則按照8000rpm 離心2min 進(jìn)行處理。

2.2 病毒 DNA 提取

采用核酸提取儀進(jìn)行DNA 提取，具體方法如下：

（1）提取試劑：廣州維伯鑫病毒總核酸提取試劑盒（磁珠法），按試劑盒說明書加入提取試劑至96 孔板相應(yīng)位置。

（2）按說明書，取待檢樣品，每份待檢樣品 50μl，加入 96孔板相應(yīng)位置。

（3）以上操作應(yīng)在二級生物安全柜中進(jìn)行。

提取結(jié)束后將提取好的DNA 與-4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 熒光定量PCR 擴(kuò)增

采用ASFV 特異熒光定量PCR 方法進(jìn)行擴(kuò)增ASFV VP72基因片段。PCR 體系為 20μl：ASFV qPCR 擴(kuò)增反應(yīng)液 17.5μl，模板 DNA 2.5μl。設(shè)立陰陽對照。密封反應(yīng)管，瞬時離心，上機(jī)擴(kuò)增，按照試劑盒熒光PCR 循環(huán)條件擴(kuò)增。

3 結(jié)論

9 月29 日經(jīng)山西省動物疫病預(yù)防控制中心實驗室檢測，確認(rèn)為非洲豬瘟陽性。

4 處置

在樣品檢測結(jié)果確認(rèn)后，省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳馬上和省市場監(jiān)督管理局組成聯(lián)合督導(dǎo)組趕到平遙縣，現(xiàn)場指導(dǎo)當(dāng)?shù)亻_展處置工作。

（1）對兩批陽性生豬產(chǎn)品全部進(jìn)行無害化處理。

（2）對被污染或可能被污染的冷庫、物品、交通工具、用具、場地進(jìn)行嚴(yán)格徹底消毒。

（3）對平遙縣某有限公司由湖南省調(diào)入山西省的生豬產(chǎn)品情況進(jìn)一步開展全面排查，消除擴(kuò)散風(fēng)險。

5 討論

5.1 對養(yǎng)豬業(yè)的影響

養(yǎng)豬業(yè)是我國歷史悠久、最主要的畜牧業(yè)產(chǎn)業(yè)，豬肉一直是我國人民的第一大肉食來源，我國也是世界上豬肉生產(chǎn)和消費第一大國[1]。山西省豬養(yǎng)殖業(yè)在畜牧業(yè)養(yǎng)殖生產(chǎn)中占有重要比重，2018 年10 月山西省發(fā)生非洲豬瘟疫情以來，生豬存欄量據(jù)不完全統(tǒng)計減少20%。所謂“豬糧安天下”，養(yǎng)豬生產(chǎn)不但為滿足我國人民群眾的消費需求起重要作用，而且在促進(jìn)農(nóng)民增收、保障農(nóng)村勞動力就業(yè)和發(fā)展農(nóng)村經(jīng)濟(jì)及推動相關(guān)產(chǎn)業(yè)等方面具有重要意義。

5.2 對人民生活的影響

豬肉價格已成為食品類甚至是中國物價的標(biāo)桿[2]。由于生豬供應(yīng)緊張，豬肉價格上漲，2019 年10 月山西省市場豬肉價格較2018 年底上漲2 倍左右，豬肉價格上漲導(dǎo)致其他畜產(chǎn)品價格也隨之上漲，直接影響人民生活質(zhì)量水平。

5.3 加強(qiáng)生豬及生豬產(chǎn)品的調(diào)運

能從豬肉產(chǎn)品中檢出非洲豬瘟病毒說明ASFV 已形成一定的污染面。為做好山西省非洲豬瘟防控工作，要嚴(yán)格落實生豬及其產(chǎn)品指定通道運輸制度，生豬及其產(chǎn)品調(diào)入山西省必須經(jīng)指定通道運輸，并加蓋山西省動物及其產(chǎn)品指定通道專用章。

5.4 持續(xù)做好非洲豬瘟防控工作

目前國內(nèi)ASF 疫情仍呈點狀散發(fā)態(tài)勢，因豬肉制品調(diào)入而傳播ASF 的風(fēng)險較高，因此，應(yīng)警惕通過污染病毒的豬肉制品而引發(fā)疫情的可能[3]。鑒于目前ASF 防控形勢仍較嚴(yán)峻，今后仍需重點排查養(yǎng)殖場、生豬交易市場、屠宰場等高風(fēng)險場點，同時根據(jù)高速公路收費制度變化，及時調(diào)整生豬及其產(chǎn)品指定通道設(shè)置方案，科學(xué)設(shè)立監(jiān)督檢查站。