豬圓環病毒不同基因型毒株間在自然條件下發生基因重組的研究進展

丁鵬 王志全 范懿娜

(1，山東省青島西海岸新區農業農村局 266400；2，山東省青島西海岸新區農業農村局 266400)

豬圓環病毒（Porcine circovirus,PCV）為圓環病毒科圓環病毒屬（Circovirus genus）成員，病毒粒子直徑為17nm，呈二十面體對稱，為圓形小顆粒狀，是目前已知最小的動物病毒之一[1-2]。根據病毒的基因組和血清學特征分為2 個型：PCV1 和PCV2。PCV1 為PK15 細胞系的一種污染物，對豬無致病性，因此，有關PCV1 的研究較少，而PCV2 對豬有致病性，能引起以斷奶仔豬多系統衰竭綜合征 （Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）為主要特征的一系列疾病。PMWS于1997 年首次在加拿大證實，自2004 年以來，世界范圍內養豬業相繼出現豬圓環病毒相關性疾病（Porcine circovirus associated disease，PCVAD) 的爆發[3-4]，該次大規模流行以高覆蓋率、高發病率和高致死率為特征，危害相當嚴重，給世界范圍內養豬業造成巨大經濟損失，近年來成為世界范圍的研究熱點。PCV1 與PCV2 具有相似的基因組構成，兩者基因組相似性約為70%。病毒基因組由單股負鏈閉環狀DNA 組成，PCV1 含1758 核苷酸（nt），PCV2 由1766～1768nt 組成。這兩種病毒包含3 個主要閱讀框（ORFs）構成，其中ORF1 編碼蛋白與病毒復制酶有關；ORF2 編碼病毒主要結構蛋白，也是病毒保護性抗原主要成分；ORF3 編碼蛋白具有誘導細胞凋亡功能，并與病毒在機體內的致病性有關[5-6]。國際上將PCV2 統一規范命名，分為PCV2a、PCV2b 和PCV2c 三個基因型[7-8]。自2000年，有關PCV2 遺傳變異的報道增多[9-10]，相對PCV2 自然重組變異的報道較少。近來，PCV 重組作為其分子遺傳變異的又一重要領域，涉及該病毒的自然重組變異機制、自然重組對其致病性及免疫原性的影響。本文歸納了近年來有關PCV 自然重組模式的研究進展，旨在為今后該病毒的重組機制及致病性研究提供借鑒。

1 PCV2 同種基因型間的重組

目前，在世界范圍內豬群中流行的主要以PCV2a 和PCV2b兩種基因型，以PCV2a 為主要基因型向PCV2b 為主要基因型轉型的趨勢。通過對國內不同地區送檢的病料樣品進行檢測和PCV2 基因組序列分析，新發現了2 個可疑的重組序列09GS（HQ395028）和HN0907 （GU938303），這2 個重組序列為09CQ （HQ395024）和Zhuji 2003 （AY579893）兩個親本毒自然重組導致的。全基因序列分析，該2 個親本毒均為PCV2b 基因型，通過不同的重組模式進行，重組交換位點分別位于ORF1 和ORF2[11]，研究表明，自然重組引起PCV2 遺傳變異的多樣性。此外，歐洲學者從臨床PMWS 病例分離到一株PCV2b重組毒株，重組位點分別位于762～871nt 和1335～1372nt[12]，其中762～871nt 位點臨近已報道的重組位點 （716～751nt 和963nt），而1335～1372nt 位點為首次報道。該位點位于ORF2內，與已報道的重組位點不同（1057～1167 和1712～1727）[13]。該研究表明，重組毒株與親本毒株相比具有較好的體外繁殖特性，預示著PCV2b 間重組將導致臨床PCV2 新基因亞型的出現。據香港學者研究發現，有3 個來自香港的PCV2 重組序列，經預測重組位點位于PCV2 復制原點和復制酶基因，還證實GenBank 中來自中國大陸的PCV2 序列也存在自然重組現象，與香港報道的重組模式相似[14]。

2 PCV2 不同基因型間的重組

對PCV2 流行毒株的遺傳變異分析表明，豬群中流行的PCV2a 和PCV2b 毒株存在共感染現象，這為不同基因型間在感染豬體內發生自然重組提供先決條件。來自韓國報道，對2005～2007 年間擴增的PCV2 全序列，通過遺傳進化分析鑒定了重組事件的可能性，結果發現2 株PCV2 重組序列，其親本毒分別為PCV2a 和PCV2b 兩種不同基因型。經重組檢測軟件分析，重組位點均發生在ORF1 區段內，證實重組對PCV2 遺傳變異進化的重要性[15]。有學者認為，當豬群自然共感染不同基因型PCV2a 和PCV2b 后，在豬體內發生自然重組表明，自然重組發生在ORF2 基因。該學者已從不同基因型PCV2 共感染豬體中獲得重組序列，其親本毒分別為PCV2a 和PCV2b，基于獲得的重組序列，構建重組毒感染性分子克隆，并在體外進行重組毒病毒拯救，獲得的重組毒株能適應體外細胞培養[16]。Hesse 等（2008）[17]從臨床病料中發現PCV2a 和PCV2b 重組序列，該重組毒ORF1 和ORF2 基因分別來自PCV2a 和PCV2b 兩種不同基因型，證實當豬群中有不同基因型PCV2 共同感染時自然重組現象可能會發生。以上所述的PCV2 重組研究的報道，均通過對來自臨床樣品的PCV2 序列分析所得，沒有經體內或體外實驗證實。相反，筆者通過不同基因型PCV2a 和PCV2b體外共感染試驗首次證實，不同基因型PCV2 體外共感染能發生重組突變體，其重組機率較小，獲得重組突變體重組位點位于ORF1 和ORF2 基因連接處及復制原點附近，該發現與上述報道不同。試驗進一步表明，重組毒具有很高體外的繁殖能力，與親本毒呈顯著差異。通過體外有限稀釋法分離到該重組毒，體外試驗表明，重組毒其繁殖效率、抗原性等均發生改變，與親本毒存在明顯差異，而有關重組毒表型的改變是否影響其致病性，尚需研究證實。

3 PCV1 和PCV2 間的重組

傳統認為，PCV1 和PCV2 為同科同屬成員，結構相似，但二者分別以相互獨立的個體形式存在，從屬于完全不同的病毒。但最新研究表明，用PCV2 型特異性鑒別熒光定量PCR 方法對臨床樣品進行檢測，由于某檢測樣品針對的ORF1 和ORF2CT 值不同，偶然發現一變異毒株，經病毒分離及序列分析發現，該變異毒株為PCV1 和PCV2 重組毒，該重組毒ORF1和ORF2 分別來自PCV1 和PCV2a 基因型病毒，按照國際PCV2 命名法則，將ORF1 來源放在前面，ORF2 來源放在后面，因此，新出現的PCV 可以命名為PCV1/2a。全基因核苷酸序列相似性比較發現，該重組毒與PCV1，PCV2a 和PCV2b 基因型的相似性分別為86.4%，88.7%和86.5%。至于該新重組毒的起源尚不明確，其致病性和抗原性有待進一步證實[18]。

4 小結與展望

自2004 年以來，PCV2 成為危害世界范圍內養豬業的頭號殺手，帶來巨大的經濟損失。有關PCV2 同種基因型或不同基因型共感染時自然重組的報道日見增多，重組機制及重組毒對豬群的致病性尚無明確報道。當前形勢下，應關注PCV 自然重組，因為PCV2 重組毒株的出現為該病毒及引起的相關疾病提出嚴重挑戰。隨著PCV2 疫苗的廣泛使用，免疫覆蓋率越來越大，作為病原而言，其生活環境面臨宿主先天性和主動免疫的壓力下，病原如何能逃避機體的免疫攻擊而在宿主體內存活下來成為病毒遺傳進化的驅動力。基于以上研究，推測PCV2 發生自然重組逃避機體免疫監控的機制有：（1）PCV2 通過重組引起其抗原性的改變，導致疫苗免疫抗體喪失或降低對病毒粒子的親和力。（2）經尚未明確的分子機制，重組雜交后病毒獲得較親本毒更高的繁殖效率，導致機體免疫對大量病毒的中和能力不足。（3）臨床上不同基因型PCV2 及重組毒共存，為世界范圍內豬圓環病的防治提出警示。至于PCV2 在疫苗免疫的壓力下，重組毒是否會成為一種強有力的生存形式值得研究者關注。