影響產油酵母菌合成油脂的因素研究現狀

陳 韻，鐘先鋒，陸麗珠，張 瑾，梁舒妍，江志彬，王漫君

（佛山科學技術學院食品科學與工程學院，廣東佛山 528225）

微生物油脂也稱單細胞油脂，可由多種產油微生物產生，包括絲狀真菌、微藻、細菌、酵母菌等[1]。根據油脂的脂肪酸組成不同，微生物油脂可用于多種用途。富含飽和及低度不飽和的長鏈脂肪酸，且脂肪酸組成與動植物油相似的微生物油脂，可用于生產生物柴油或可可脂替代品[2]。另一方面，微生物油具有豐富的多不飽和脂肪酸（PUFAs），可以應用于保健品和必需脂肪酸的生產[3]。

產油微生物種類繁多，就單細胞油脂的生產而言，酵母菌與其他微生物相比具有許多優點。首先，與微藻相比，酵母菌的發酵受氣候的影響較小，另一方面，酵母菌還可以利用多種多樣的糖類和其他簡單化合物作為碳源。再者，與真菌相比，酵母菌對氧氣的需求量更低，對金屬離子也具有更高的耐受性。此外，由于細胞體積較大，酵母菌細胞比細菌更容易收獲。根據相關報道，與其他微生物相比，酵母菌較容易進行基因工程改造。因其優點突出，含油酵母的脂質生產在近幾年來一直是各國的研究熱點之一[4]。但含油酵母菌產油發酵受多種因素影響，主要有pH 值、溫度、發酵時間、接種量、溶氧量等的培養環境條件和碳源、氮源、無機鹽、生長因子、前體物質等培養基成分[5]。在利用酵母菌發酵產油脂的過程中，通過控制培養環境條件和添加不同的營養成分，可得到不同脂肪酸組成的微生物油脂，實現微生物油脂在不同行業中的應用[6]。主要針對影響產油酵母菌發酵產油脂的培養環境條件和培養基成分等因素進行了綜述，以期為產油酵母菌生產微生物油脂的工業化發展提供參考。

1 產油酵母

在已知的約600 種酵母中，只有不到30 種是產油酵母，其中有代表性的有耶氏酵母屬、隱球酵母屬、紅酵母屬、紅冬孢酵母屬、根霉菌屬、毛孢子菌屬和油脂酵母屬[7]。大多數油脂酵母體內油脂含量達40%，一些產油酵母菌株甚至可以積累高達70%的中性脂質。

常見的油脂酵母主要有解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）、斯達氏油脂酵母（Lipomyces starkeyi）、圓紅冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）、皮狀絲孢酵母（Trichosporon cutaneum）、彎曲隱球酵母（Cryptococcus curvata）、白色隱球酵母（Cryptococcus albidus），其中解脂耶氏酵母被證明可以將農用工業殘留物、工業甘油和廢棄脂肪轉化為甘油三酯[8]；圓紅冬孢酵母油脂含量最高，但利用廢液的能力較差[9]。

2 影響產油酵母生產油脂的環境條件

2.1 接種量

接種量能夠影響酵母菌的生長和油脂產量[10]。接種量較小時，發酵液中的生物量較少，油脂產量會相對較少；接種量越大，一般越有利于細胞生長，但脂質積累有最佳的接種濃度。有研究發現，隨著接種量增加，油脂產量不斷增加并達到較大產量，繼續增加接種量，油脂產量反而會下降[11]。據Liu L P 等人[12]推測，較高的接種量有利于細胞內多糖的合成，因此接種量越高菌體生長越旺盛，但較高的接種量可能會增加氮濃度，從而誘導降低發酵培養基中C/N 比，而這是不利于脂質積累的。Chen X F 等人[13]也發現在木質纖維素水解產物上進行產脂發酵時，過高的接種量不利于微生物油脂的積累。

2.2 pH 值

pH 值是影響微生物正常生命活動的重要因素。培養基pH 值會影響到合成油脂過程中關鍵酶的活性和微生物細胞膜的結構。當pH 值發生變化時，發酵液中離子的濃度也會發生改變，過高或過低的離子濃度都會影響細胞對培養基中離子的吸收和利用，最終影響菌體的生產繁殖和油脂積累[14]。胡洋[15]考查了pH 值4.0～8.0 對T. fermentans，T. cutaneum 和L. starkeyi 產油脂的影響，隨著pH 值增大時，3 種酵母菌的生物量、油脂含量和油脂產率都在不斷增大；當培養基的初始pH 值超過6.0 時，以上指標均開始減小。周晶[16]也發現，當發酵液的pH 值過高或過低時，菌體生長繁殖都會受到抑制。

2.3 溫度

溫度是酵母菌培養最重要的環境因素之一，通常在最終發酵油脂產量中起關鍵作用。大多數酵母菌的最佳發酵溫度為28～32 ℃。例如，酵母菌傾向于在低于20 ℃的溫度下減慢生長，而在高于35 ℃的溫度下其生命活動基本上被抑制。因此，控制培養溫度能夠獲得較高產量的微生物油脂。李楠[17]考查了溫度對微生物的生長和積累油脂的影響。結果表明，培養溫度較低時，微生物生長緩慢，生長遲緩期長；隨著環境溫度的提高，微生物生長速度加快，其生長周期縮短，油脂產量也顯著提高。但是，在35 ℃時菌種停止生長，說明低溫和高溫均不利于微生物的生長。因此，脂肪酶的活性具有溫度依賴性，酵母菌油脂的產生與培養溫度有關，這可能源于在較低或較高溫度下參與脂質合成酶的部分失活。

2.4 溶氧量及搖床速度

在搖瓶發酵培養中，發酵液中溶氧量的控制主要是通過控制搖床速度來實現，搖床速度越快，發酵液中的溶氧量就越大，反之則越小。產油酵母在發酵產油脂的過程中需要消耗氧氣，在適當的轉速下，發酵液中氧氣供應充足，有利于微生物油脂的積累，當搖床速度過快，菌體生長速度過快，耗氧代謝旺盛反而不利于油脂的積累。同時，過快的速度容易損傷菌體，甚至導致菌體自溶死亡，最終使菌體油脂含量下降。王莉等人[18]研究了搖床速度對菌體產油脂的影響，在轉速190 r/min 時，生物量和油脂產量均達到最大值，當搖床速度過高或過低時，以上指標均會下降。

2.5 培養時間

Ma Y Q 等人[19]發現，培養時間的長短對油脂積累和脂肪酸的組成起著重要的作用。培養時間較短時，菌體主要利用營養物質生長繁殖，此時菌體處于對數期，生長旺盛，但是油脂未完全形成，菌體積累的油脂量較少；培養時間過長，發酵液中的營養物質基本被耗盡，繼續培養會導致菌體處于饑餓狀態，此時菌體為了維持正常的生命活動會消耗自身產生的油脂來獲得能量，菌體處于衰亡期，最終會死亡而自溶，從而導致油脂產量下降。王斐[1]研究了不同培養時間對D5-2 菌株油脂的影響，結果表明，發酵初期菌體的生物量和油脂含量迅速增長，到了8 d 后，隨著時間的增加，油脂含量和生物量均呈下降趨勢，說明此時菌種處于衰亡期。

3 影響產油酵母生產油脂的培養基成分

3.1 碳源

碳源作為酵母菌生長和產脂質的重要營養成分，在氮源缺乏的情況下，酵母菌利用碳源代謝合成油脂。常見的碳源有糖類（葡萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉）、二氧化碳、碳酸鹽、脂類、有機酸等，考慮到生產成本，目前已經探索了許多不同種類的可再生和廉價碳源用于異養含油微生物的脂質生產，包括木質纖維素、非谷物糖原料、粗甘油、食品廢水、工業有機廢物、甲殼素、菊芋等[18，20]。不同種類的碳源會影響微生物生長繁殖和油脂合成，不同種類的酵母菌所能利用的碳源也不同。孫登岳[20]添加不同種類碳源到培養基中，發現葡萄糖最適宜ZL2-103 菌株發酵產油脂，相對于葡萄糖來說，木糖、阿拉伯糖、甘露糖、蔗糖及麥芽糖不太適合ZL2-103 發酵生產油脂。

3.2 氮源

氮源是在菌種生長和油脂合成過程中必不可少的營養物質，主要用于構成微生物的蛋白質、細胞質等物質，常見的氮源包括有機氮（蛋白胨、酵母提取物、玉米漿、尿素等） 和無機氮（NH4Cl，NaNO3，NH4NO3等）[21]。有研究表明，無機氮源比有機氮源更有益于脂質積累，使用的氮源可能通過氮代謝的差異來影響脂質的合成[21]。Poli J S 等人[22]評估了由3 種有機氮源（酵母提取物、胰蛋白胨和尿素） 和2 種無機氮源（[NH4）2SO4和NH4NO3]組成的5 種氮源促進脂質積累的能力，也發現無機氮比有機氮更能誘導脂質的合成。

3.3 C/N 比

C/N 比也是影響脂質生成的重要參數。研究表明，當發酵液中碳源供應充足、氮源不足，或者人為進行氮源剝奪的情況下，能夠促進微生物脂質的積累[23]。一般情況下，高的C/N 有利于脂質的積累并促進菌體的生長，但較高的C/N 會導致菌體生物量下降。Lui L P 等人[12]研究了C/N 比范圍在40～140 對L. starkeyi 菌體生長和脂質積累的影響，試驗通過改變氮源濃度實現不同的C/N 比，發現隨著C/N 比從40 增加到60，生物量從16.8 g/L 提高到18.3 g/L，但隨著C/N 比進一步增加，生物量逐漸降低，菌體的油脂含量會不斷增加。研究認為，L. starkeyi 的生物量下降可能是由于氮源濃度的降低[12]。這說明氮源供應充足時，有利于細胞的生長繁殖，氮源缺乏和碳源充足的情況下，碳源會進一步代謝成為油脂并存儲在菌體中。

3.4 無機鹽

除了有限的氮源外，添加無機鹽對不同的含油微生物的生長和脂質積累有顯著的效果，無機鹽包括金屬離子，以及S，P，Mg 等微量元素，研究發現金屬離子能夠參與細胞膜的構成，還會影響脂肪酶的活性，進而影響油脂的積累。向培養基中添加適量無機鹽能夠調節發酵體系的pH 值大小和滲透壓，有利于體系中油脂的積累和穩定。Chen X F 等人[13]通過添加不同種類的無機鹽到玉米芯酸水解產物中，結果發現添加適量無機鹽能夠顯著刺激菌株T. cutaneum CH002 的生長和油脂的合成。

3.5 前體物質

前體物質是指微生物油脂在合成過程中所產生的中間物質（如輔酶A、甘油、檸檬酸、蘋果酸等），在微生物油脂合成過程中添加這類物質，能夠刺激體系中油脂的合成，從而提高油脂的含量[23]。王斐[1]通過響應面優化法研究了輔酶A、甘油、檸檬酸等前體物質對D5-2 菌株產生長及產油脂的影響，結果表明，添加前體物質能夠顯著提高油脂產量，這些物質按一定的比例混合加入，其效果比加入單一的物質更顯著。

3.6 生長因子

生長因子是在酵母菌培養中加入到培養基中的物質，這些物質能夠影響體系中脂肪酶活性，如乙酸鹽、氨基酸，以及某些維B 類物質，可提高油脂的含量。孫登岳[21]通過添加乙酸鹽來實現對脂質代謝調控，李楠[17]通過添加維B1和維B6來提高油脂的不飽和度。

4 結語

目前，微生物油脂正廣泛應于生物柴油的生產，作為一種生物可再生原料，可以通過微生物利用各種碳源生產得到，也可以通過各種技術和途徑有效培養和收獲，通過控制pH 值、溫度、溶氧量，或者添加無機鹽、前體物質等能夠增大油脂產量，還能夠進一步增大目標脂肪酸所占比例。然而，開發大規模微生物油脂生產還面臨很多的限制和挑戰。因此，應該緊急開發和設計一些解決方案用于未來的工業化生產，包括廉價碳源的開發、含油微生物的篩選和改良、高效細胞壁破碎的開發、采油技術與新型微孔催化劑的開發和再生技術等。