漁用口服疫苗在水產養殖上的應用

（河南師范大學水產學院，河南新鄉453007）

隨著水產養殖業的快速發展，我國進行規模化水產養殖的種類已達60多種，據《中國漁業統計年鑒（2018）》測算，2017年我國水產品總產量6445.3萬t。據FAO（Food and Agriculture Organization of the United Nation）統計，近十年我國水產養殖總產量連續以5%-6%的增長速率穩步增長[1-2]，且我國已成為世界上最大的水產品生產、消費和進出口國家。與此同時，隨著集約化養殖的程度不斷提高，魚類病害也急劇增加，給我國水產養殖業帶來巨大損失。目前，國內水產動物疾病的防治仍主要依賴抗生素和化學類藥物的使用，藥物濫用給水產品質量安全及水環境保護帶來嚴重的風險。漁用疫苗可有效防控水產動物疾病發生，可減少抗生素和化學類藥物的濫用。其中漁用口服疫苗與其他免疫方式相比，具有能降低對水產動物的機械損傷、節省人力物力、降低養殖成本等優點，應用前景較好。

1 口服疫苗特點

漁用口服疫苗是滅活疫苗、減毒活疫苗和核酸疫苗等疫苗通過包封或生物載體等技術處理之后，以口服方式對水產動物進行免疫接種的一類疫苗統稱。口服方式適用于不同規格的水產動物，不受其大小和年齡的限制，因此不易引起機體產生應激反應。與注射免疫相比，能減少對水產動物造成的機械損傷，可在一定程度上大大節省人力物力、提高免疫效率，從而降低養殖成本，同時也滿足了動物福利的要求。目前，國內外水產養殖大部分朝著集約化和工廠化方向發展，與其他免疫接種方法相比，口服法免疫更適合大規模養殖水產動物的免疫，尤其適合于多次重復免疫操作[3]。但目前漁用口服疫苗的研發和應用還不夠廣泛，其制約因素主要是疫苗在胃和腸道中受到胃酸和消化酶作用，免疫原性易遭到不同程度的破壞，使其不能在后腸引發相應的粘膜免疫及系統免疫反應，從而不能引起足夠的免疫原性，除此之外還可能誘導免疫耐受性。

2 口服疫苗免疫機理

魚類口服疫苗引起的免疫主要以粘膜免疫為主，與哺乳動物相比，魚類胃腸道粘膜免疫和抗原攝取的研究還處于起步階段[4]，根據腸上皮細胞形態，魚類腸道一般可分為三段，前段占腸總長度的60%-75%，含有脂類吸收的腸上皮細胞；中段占腸總長度的20%-25%，腸細胞特征是核外有大的液泡，并且胞飲活性高；后段占腸總長度的5%-15%，后腸上皮細胞具有滲透調節的功能，且有短微絨毛[5]，但各段腸道中淋巴細胞亞群和分泌性免疫球蛋白分布的研究報道較少。

哺乳動物腸壁內存在著大量淋巴組織，構成腸道免疫的第1道防線。腸相關淋巴組織、小腸的派氏集合淋巴結、腸系膜淋巴結、闌尾、氣管相關淋巴組織、淚腺、腮腺、扁桃體和乳腺等相互連接，形成共同粘膜免疫系統，是抗原進入粘膜并產生特異性免疫應答的主要部位。在粘膜免疫中發揮重要作用的SIgA形成局部粘膜區域，隨著細菌入侵，當上皮表面免疫活性細胞受到細菌粘附素刺激時，粘膜局部便產生SIgA，阻止腸道微生物及其毒素分子對胃腸粘膜的攻擊[6]。然而，目前還不清楚魚類是否擁有同樣作用的共同粘膜免疫系統，但現已證實，魚類后段腸細胞的胞飲能力與哺乳動物腸道的M細胞相似，能吸收和轉運可溶性或顆粒性抗原，并可迅速將抗原釋放到細胞間隙，在此處當抗原遇到上皮內巨噬細胞時，巨噬細胞在細胞膜上顯示抗原決定簇，有抗原呈遞功能[7,8]。

硬骨魚中粘膜相關淋巴組織主要分布于鰓、皮膚、腸道和鼻咽等部位，其中由若干種淋巴細胞、巨噬細胞、粒細胞和漿細胞組成腸道相關淋巴組織，B細胞是該粘膜相關免疫系統的主要應答者之一，這些淋巴細胞產生的免疫球蛋白（如IgM和IgT）是抵御病原體的關鍵防線[9]。目前關于如何減少胃腸道對口服疫苗的降解和提高免疫反應性，使口服疫苗高效應用是研究的熱點。

3 口服疫苗種類及其應用

口服疫苗可有效激發腸粘膜免疫，給藥途徑簡單、安全，且種類繁多，按疫苗類型主要包括菌苗、病毒疫苗、蛋白質亞單位疫苗、合成肽疫苗、基因缺失疫苗、DNA疫苗及轉基因植物疫苗等[10]；通過不同處理包封方式還可分為聚合微球體和生物被膜制備的佐劑疫苗以及生物載體疫苗。聚合微球體的包裹材料主要有海藻酸鹽、殼聚糖和葡聚糖等，生物被膜有細胞外聚集物質、滅活菌體的聚乳酸-乙酸共聚物和復乳揮發法制備的含嗜水氣單胞菌被膜等，生物載體有昆蟲（鹵蟲幼體、甜菜夜蛾、蠶蛹等），益生菌（枯草芽孢桿菌、酵母菌等），植物（衣藻、魚腥藻和馬鈴薯等）及病毒等。下面就常見口服疫苗進行介紹。

3.1 微囊疫苗

可生物降解微球作為口服疫苗的新型載體，因其具有降解速度緩慢且可以控釋、增強免疫應答、減少接種次數、口服免疫可減少消化液破壞等優點而備受青睞[11]，隨著微囊疫苗工藝的不斷成熟，漁用囊膜疫苗已經在實驗室內取得了較好的免疫效果。1997年Joosten等[12]研制了虹鱒微囊化口服疫苗，首次將疫苗微囊化應用到水產養殖。高銘蔚等[13]用1%福爾馬林滅活無乳鏈球菌，由聚乳酸一羥基乙酸[poly(D,L-lactic-CO-glycolic)acid，PLGA]包裹制備口服疫苗，采用口服法免疫尼羅羅非魚，研究表明，與陽性對照相比，其抗體可在高水平維持較長時間，可見PLGA微球口服疫苗具有控制疫苗釋放，延長免疫的作用，從而增強羅非魚對病菌的抵抗能力。李新華等[1 4]用0.5%福爾馬林滅活嗜水氣單胞菌，由海藻酸鈉包裹制備的疫苗口服免疫銀鯽，結果表明實驗組相對百分比成活率為61.1%，高于對照組的50%，這說明微囊疫苗可以提高免疫保護性。此外，由海藻酸鹽包裹的傳染性胰腺壞死病毒（IPNV）的DNA疫苗口服免疫虹鱒和褐鱒，攻毒后相對百分比成活率可達到80%[15]，但是Embregts等[16]用海藻酸鈉包封的鯉春病毒血癥病毒DNA疫苗和基于昆蟲細胞表達的亞單位疫苗口服免疫鯉，均未達到預期保護率，與對照組相比甚至加速了鯉的死亡，分析原因可能是海藻酸鹽不一定是通用的封裝基質，也可能是劑量和接種程序不適宜，綜上所述，口服疫苗所需包封基質應針對魚的種類和特定病原體進行調整和應用。

3.2 生物載體疫苗

生物載體疫苗又稱活載體疫苗，是利用基因工程技術將外源抗原在微生物或動植物載體中表達的疫苗。生物載體疫苗具有免疫效力高、成本低及安全性好等優點，是未來疫苗研制與開發最有潛力的發展方向[17]。此類疫苗技術主要用于人類和畜禽類疫苗開發，在漁業上應用并不成熟。目前，細菌、酵母、昆蟲、哺乳動物細胞和植物[18]等生物載體已被用于表達外源蛋白。

Han等[19]針對鯽嗜水氣單胞菌病，選用嗜水氣單胞菌的OmpG作為抗原蛋白，在生物載體釀酒酵母中表達，口服免疫鯽后，通過免疫組織化學檢測到鯽腸道粘膜表達抗原蛋白基因，且特異性抗體顯著增加，累計死亡率為46.7%，相比陰性對照組有了明顯的下降。Seong等[18]將神經壞死病毒的衣殼蛋白作為抗原蛋白在煙草葉綠體中成功表達，對小鼠和斑馬魚進行口服免疫，通過ELISA的方法在小鼠和斑馬魚體中檢測出特異性抗體，且加免疫佐劑組表達顯著，就斑馬魚而言，累計死亡率顯著降低。Lin[20]等利用鹵蟲傳遞含有表達神經壞死病毒衣殼蛋白的重組大腸桿菌，對斑馬魚幼魚進行口服免疫，通過免疫組織化學檢測到斑馬魚后腸中有此抗原蛋白基因的表達，且特異性抗體顯著增加，免疫保護率達到69.5%。綜上所述，生物載體疫苗比其它疫苗，在表達外源抗原成分時有更多選擇性，并且在抗原呈遞方面有效性較高[21]，但通過生物載體表達的蛋白一般效率不高，且口服接種保護率相比注射等方式較低，因此，篩選高效表達的生物載體，探索提高口服疫苗免疫保護率的方法和技術將是未來研究的重要方向。

4 總結與展望

漁用口服疫苗通過口服進行免疫是一種較為方便的免疫方式，且不受接種對象規格大小、口服疫苗種類、接種時間和次數等限制。漁用口服疫苗在水產養殖中有著廣闊的應用前景，口服疫苗不僅有效避免了由于注射引起的機體的應激反應和損傷，而且可以減少人力物力，降低養殖成本，在養殖生產中易于推廣和應用。口服疫苗在腸道中主要以黏膜免疫為主，但目前其免疫機理并不清楚，今后應加強口服疫苗引起的黏膜免疫效應及機理研究。此外，口服免疫保護率較低，口服疫苗遞送系統研究處于初級階段，口服疫苗的高效導入和提高免疫效果應是今后的研究重點。因此，今后應從基礎研究和應用開發兩方面著手，立足漁業生產中魚病防控，加強漁用口服疫苗的研發和應用，提高口服疫苗的免疫保護率，以更好地應用于漁業生產，防控魚類疾病發生，對于水產健康養殖的可持續發展將具有重要意義。