非洲豬瘟病毒及診斷技術研究進展

康亞男 張小波 劉 濤 張 倩 張 英 朱秀同 趙玉龍 吳雅清 鄭朝朝 劉 博

（1 瑞普（保定） 生物藥業有限公司， 河北保定 071000； 2 天津瑞普生物技術股份有限公司， 天津 300308；3 廊坊市加一農業發展有限公司， 河北廊坊 065000； 4 衡水市動物疫病預防控制中心， 河北衡水 053099）

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒引起的豬的一種高度接觸性傳染病，臨床以高熱、皮膚和內臟廣泛性出血、神經癥狀、腹瀉、死亡為主要特征。非洲豬瘟病毒（ASFV）是非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬的唯一成員。ASFV 是一個復雜的二十面體DNA 病毒，病毒粒子包含許多同軸心結構，外部有六角形膜，病毒粒子的平均直徑大約為200 nm。豬病學資料顯示[1]，ASFV 有22 個基因型，截止目前國內專家相關報道稱ASFV 已有24 個基因型，我國流行的是基因Ⅱ型、血清8 群，與俄羅斯和東歐國家的流行毒株屬于同一分支。

ASFV 基因組包括一個線性的雙鏈DNA 分子，病毒基因組大小170～190 kb，能編碼100 種以上的蛋白質分子。ASFV 存在于急性病豬的血液、組織液、體液、分泌物和排泄物中，具有很強的生存能力，具有適應溫度、pH 值范圍廣，在pH 值4～13.2 的范圍內均能穩定存活。該病毒感染途徑和傳播方式眾多，健康豬與病豬或其污染物直接接觸、間接接觸，通過消化道、呼吸道、血液、污染車輛等均能感染該病。感染ASFV 后2～3 d即可排毒，可持續數周，康復后仍可排毒。

1 非洲豬瘟疫病發展情況[2-4]

20 世紀20 年代，非洲豬瘟病毒首次在肯尼亞被發現，1957 年在伊比利亞半島流行，20 世紀90 年代中期馬耳他、意大利、法國、比利時、荷蘭相繼發生非洲豬瘟疫情，1978 年撒丁島發生疫情，至今非洲豬瘟在撒丁島呈地方性流行。2007 年非洲豬瘟首次進入高加索地區，2009 年傳入俄羅斯，2012 年從俄羅斯轉向烏克蘭，2013 年轉入白俄羅斯，2014 年直接進入了歐盟國家，如立陶宛、波蘭、拉脫維亞、愛沙尼亞等國家。2015 年至2018 年期間，家豬發生非洲豬瘟的報道只有1 起，其他均為野豬感染案例。

2018 年8 月，我國遼寧沈陽發生首例非洲豬瘟疫情，中國動物衛生與流行病學中心國家非洲豬瘟參考實驗室吳曉東研究員[4]報告的數據顯示，截至2019 年10月底，全國已有31 個省份發生非洲豬瘟疫情158 起，其中家豬感染154 起、野豬感染4 起，共撲殺生豬116萬頭。2019 年1 月，蒙古國6 個地區發生10 起非洲豬瘟疫情，撲殺生豬1 144 頭；2019 年2 月，越南地區發生非洲豬瘟疫情，共撲殺生豬379.85 萬頭。2018 年我國發生疫情最嚴重的地區有遼寧、安徽、黑龍江等，2019 年發生疫情最嚴重的地區有貴州、海南、廣西、云南等。

2 非洲豬瘟診斷技術

非洲豬瘟抗原檢測方法有紅細胞吸附試驗、熒光抗體試驗、PCR 技術、熒光定量PCR 技術、環介導等溫擴增技術等[5]。抗體檢測技術主要是酶聯免疫吸附試驗等。

2.1 紅細胞吸附試驗（HAD）

HAD 最適合用來評估發生疑似疫病的豬群。該試驗是利用紅細胞能吸附在體外培養的感染ASFV 的巨噬細胞膜表面。ASFV 誘導細胞出現病變前，紅細胞能在巨噬細胞周圍形成典型的玫瑰花環，這是ASFV 病毒的特異性。但是目前文獻報道，有的分離株能誘導巨噬細胞出現病變，但是不能形成紅細胞吸附現象。

2.2 直接免疫熒光（DIF） 試驗

免疫熒光檢測方法主要用于豬的脾臟、肺臟、淋巴結、腎臟等組織器官的抗原檢測，組織觸片或者冷凍切片后，利用特異性的熒光抗體與抗原結合的原理，通過顯微鏡觀察熒光顯色結果。該方法的局限性是不能用于鑒定不產生HAD 的非洲豬瘟病毒毒株。該方法對于急性病例的檢出率高，但對于亞急性和慢性病例的檢出率較低。

2.3 聚合酶鏈式反應（PCR）

目前，聚合酶鏈式反應是檢測ASFV 最常用的實驗室檢測方法。針對不同的基因設計不同的特異性引物，能達到快速診斷的目的。早在2009 年我國曾少靈等[6]利用GenBank 上公布的非洲豬瘟病毒結構蛋白基因vp73的序列，設計了特異性引物，建立了ASFV 的PCR 診斷方法，并與世界動物衛生組織（OIE）推薦的方法進行了對比試驗，結果顯示2 種方法的特異性相當，自建方法的靈敏度高于OIE 推薦方法至少100 倍。2012 年吳憶春等[7]根據ASFV vp73 基因保守區域設計引物，建立了非洲豬瘟病毒PCR 檢測試劑盒，檢測靈敏度能達到10-7ng/μL。張倩等[8]建立了非洲豬瘟與豬瘟雙重PCR方法，對ASFV 和CSFV 的最低檢出量均可達到100 pg，為ASFV 和CSFV 的臨床鑒別診斷和流行病學的調查提供了有效的技術支持。

2.4 熒光定量PCR 法

熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR,RTFQ PCR）是美國Applied Biosystems 公司1996 年推出的一種新定量試驗技術，它是通過熒光染料或熒光標記的特異性探針對PCR 產物進行標記跟蹤，實時在線監控反應過程的一種核酸定量檢測的新技術，具有敏感性高、特異性好、定量準確、快速、實時等特點。在我國，隨著PCR 技術的發展，對非洲豬瘟病毒的研究也邁上了新的臺階。自2009 年以來，陸續建立了非洲豬瘟病毒熒光PCR 診斷法，填補了國內技術空白。2009 年，天津出入境檢驗檢疫局董志珍等[9]利用ASFV的p54 基因的核苷酸序列設計了特異性引物，并合成FAM 基團標記的探針，建立了熒光定量PCR 法，最低可檢出15 個拷貝數/μL 的樣品，靈敏度和特異性較高。2010 年，黃萍等[10]利用ASFV 的p72 基因的核苷酸序列設計了引物和探針，建立了熒光定量PCR 法，該方法的敏感性達到100 個拷貝數。同年，曾少靈等[11]利用ASFV 的vp73 基因的保守序列設計了引物和TaqMan 探針，建立了熒光PCR 檢測方法，該方法的最低檢測限為10 個拷貝數/μL，與OIE 推薦的熒光PCR 檢測方法靈敏度和特異性均相當。

2.5 其他檢測方法

2.5.1 環介導等溫擴增技術（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）

James 等[12]以ASFV 異構酶Ⅱ型基因為靶點構建的LAMP 檢測方法，其靈敏度不低于330 個拷貝數。楊吉飛等[13]利用p72 基因設計引物，建立了非洲豬瘟病毒的環介導恒溫擴增技術。將LAMP 與OIE 參考的PCR 檢測方法進行比較，該項技術對非洲豬瘟參考實驗室提供的非洲豬瘟病毒17 個毒株的基因組均能進行成功的擴增。

2.5.2 交叉引物擴增——試紙條法

面對非洲豬瘟的挑戰，中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所豬烈性傳染病創新團隊建立了一種交叉引物擴增——診斷試紙聯用的檢測方法。該方法可完成現場檢測，具有快速、靈敏、簡便的特點，但是該方法為單通道檢測方法，難以實現疫病的普查。

2.6 抗體檢測技術

2.6.1 膠體金試紙條法

張鑫宇等[14]建立了p54 抗體膠體金檢測法，分別以葡萄球菌A 蛋白（SPA）和抗p54 多克隆抗體作為檢測線和質控線，制作了ASFV p54 抗體檢測膠體金免疫分析試紙條，臨床樣品的符合率高于OIE 推薦的ELISA 方法，該項技術在今后ASFV 的防控中具有良好的應用前景。

2.6.2 ELISA 抗體檢測方法

非洲豬瘟病毒有54 種結構蛋白，大部分的結構蛋白具有良好的抗原性，其中p72、vp73、p54、p30 等蛋白常被作為研究對象。梁云浩[15]針對非洲豬瘟病毒蛋白p54 進行了克隆表達，建立了血清抗體間接ELISA測定的方法，該方法具有靈敏、特異、簡便的特點，為凈化非洲豬瘟病毒奠定了基礎。基于非洲豬瘟病毒p54蛋白抗原表位，曹琛福[16]同樣建立了血清抗體競爭ELISA檢測方法，并形成了深圳市地方性標準《非洲豬瘟病毒抗體檢測阻斷酶聯免疫吸附法》 （SZDB/Z 131-2015），為我國動物疫病檢測提供了標準性指導文件。

3 小結

自2018 年8 月非洲豬瘟疫情在我國發生以來，針對非洲豬瘟病毒抗原、抗體檢測的技術層出不窮，中國動物疫病預防控制中心組織了非洲豬瘟現場快速檢測評審，對各種檢測方法進行了技術把關，為非洲豬瘟病毒疫病防控提供了技術保證。中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所針對非洲豬瘟病毒疫苗的研制有了突破性進展，該病的防控和凈化歷程是長期的過程，ASFV 的早期診斷是控制和預防非洲豬瘟病毒蔓延的重要手段，快速、準確、便捷的診斷技術是發展的重要方向[17]。