金花茶黃酮類化合物的生物學功能及提取分離測定方法研究進展

張佩霞，于 波，鄒春萍，黃麗麗，趙超藝，孫映波

（廣東省農業科學院環境園藝研究所/農業農村部華南都市農業重點實驗室/廣東省園林花卉種質創新綜合利用重點實驗室，廣東 廣州 510640）

金花茶（Camellia nitidissima）是山茶科山茶屬金花茶組植物，于20世紀60年代在我國廣西首次被發現，是茶花家族中唯一開黃色花的物種。金花茶被賦予“神奇的東方魔茶”“植物界大熊貓”“茶族皇后”的美譽［1］，并被納入我國珍稀瀕危保護物種之列。現有諸多研究結果表明，金花茶含有豐富的黃酮類化合物［2-4］，黃酮類化合物作為一種天然的植物次生代謝物，具有多種生物學功能，包括抗氧化［5］、降血糖［6］、抗癌［7-8］、抗腫瘤等［9-10］，其中以抗氧化作用最為突出，并構成其他功能的基礎。人體許多疾病的發生源于體內自由基過多，而黃酮類化合物的強抗氧化性可有效清除、抑制自由基，且能避免體細胞因受到氧化而衰老［11］。基于黃酮類化合物的以上生物學功能，可開發出相關藥品和保健品，以預防相關疾病的發生及延緩衰老等，目前市場上有較多金花茶黃酮類相關的初級食用產品［12］，但缺乏金深加工產品，如要實現深加工，則需要掌握金花茶黃酮類化合物的高效提取、分離及測定方法，并深知金花茶中各種黃酮類化合物生物學功能。關于金花茶黃酮類化合物的提取方法，主要有有機溶劑提取法［13］、超聲波輔助提取［14］以及應用較少的酶解法［15］；金花茶黃酮類化合物的分離大多采用大孔樹脂吸附法［16］及色譜法［17］，膜分離法較少應用［18-19］；金花茶黃酮類化合物的測定方法以分光光度法為主［20］，高效液相色譜法［21-23］及液相色譜與質譜聯用法具有較大應用潛力［24］。鑒于金花茶黃酮類化合物的相關理論研究較為缺乏，本研究就黃酮類化合物及金花茶中已分離鑒定出的黃酮類具體成分進行了詳細闡述，對黃酮類化合物的多種生物學功能進行了綜述，并對金花茶中黃酮類化合物提取、分離、測定的各種方法及其優缺點等進行了分析，以期為今后金花茶中黃酮類化合物的高效提取分離測定方法的選擇應用及醫藥保健等產品的開發利用提供理論支撐。

1 黃酮類化合物及金花茶黃酮類成分

1.1 黃酮類化合物

黃酮類化合物是一種天然的植物次生代謝產物，一般指兩個苯環通過中央三碳鏈相互連結而成的一系列具有C6-C3-C6基本結構的化合物［25］，各種天然黃酮類化合物都是在此基本結構上形成的衍生物。黃酮類化合物由于助色團而呈現黃色，不但種類繁多，而且結構類型各異，生物活性具有多樣化。現已分離鑒定出9 000多種黃酮類化合物，從結構上來看，不同黃酮類化合物其黃酮骨架上羥基、甲基以及配糖體等取代基組合方式存在差異［26］，這是黃酮類化合物種類多樣性的重要原因。根據結構上的不同，可大致將黃酮類化合物分為黃酮、黃酮醇、黃烷醇、黃烷酮、二氫黃酮醇、花色素和異黃酮類物質［27］。

1.2 金花茶黃酮類化合物

許多研究者對金花茶中黃酮類化合物的成分進行了深入探究，發現了不同結構的黃酮類化合物。陳全斌等［2］以金花茶葉為試驗材料，先提取了其中的總黃酮，然后通過分離技術獲得高純度甙元，經過色譜結合核磁共振等方法，對其黃酮成分進行結構判斷，首次發現金花茶的葉片中含有黃酮甙，也證實了其甙元為槲皮素和山奈酚。彭曉等［3］利用色譜法從金花茶中分離出槲皮素、槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、蘆丁、牡荊素、山奈酚、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷等7種黃酮類化合物。Peng等［4］從金花茶花瓣中分離得到槲皮素7-O-（6″-O-E-咖啡酰）-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素、槲皮素3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和槲皮素7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等4種黃酮類化合物，還鑒定出一種新的酰化類黃酮糖苷。黃艷等［28］從顯脈金花茶葉片中分離得到7個單體化合物，其中包含括山萘酚。周潔潔等［29］從長柱金花茶中分離并鑒定得到5，7-二羥基色原酮-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、落新婦苷、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖等4種黃酮類化合物。鄒登峰等［30］從金花茶中分離得到蘆丁和芹菜素6，8-二-C-β-吡喃葡萄糖苷兩種黃酮類化合物。梁香等［31］采用液相色譜與質譜聯用法檢測金花茶中的黃酮成分，發現了兒茶素、表沒食子兒茶素、兒茶酚、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、蘆丁、異槲皮苷、花青素、槲皮素、山柰酚、兒茶素沒食子酸酯等黃酮類活性成分。很多研究結果表明，金花茶中黃酮類化合物種類具有多樣性，其種類不僅與金花茶品種有關，而且提取分離方法不同也會影響鑒定結果。在金花茶黃酮類化合物的提取分離測定方面，還需要有一套標準化的操作規程。金花茶原生種有40多種，目前研究結果只是對常見的幾種金花茶進行了黃酮類化合物的提取和鑒定，其他種類金花茶中的黃酮類化合物還需要提取、分離并鑒定。

2 金花茶黃酮類化合物的功能

2.1 抗氧化功能

研究結果表明，人體各種疾病的發生源于體內自由基的增多，而黃酮類化合物在清除、抑制自由基方面具有顯著功效，表現出較強的抗氧化性，從而避免機體因受到氧化攻擊而產生衰老［11］。寧恩創等［5］通過大孔樹脂分離出金花茶中的黃酮，然后構建了不同的體外自由基體系，以測定金花茶中黃酮的體外抗氧化性，結果發現：金花茶所含黃酮類化合物在低濃度時就能實現對羥基自由基的清除，并表現出劑量效應；在清除超氧陰離子自由基效果更為明顯，也呈現出較好的劑量效應，且優于對照組的茶多酚；能有效抑制ROO·自由基的產生。李石容［17］研究發現，金花茶黃酮類化合物3個組分YKC1、YKC2、YKC3對羥基自由基的清除率呈劑量關系，當YKC2濃度為1.2 mg/mL時清除率為71.3%；金花茶黃酮類化合物對超氧陰離子自由基的清除效果表現為當YKC2濃度為0.25 mg/mL時，清除率為57.8%；各組分對DPPH自由基均有很好的清除效果。周潔潔［32］通過體外自由基體系，利用分光光度法對長柱金花茶葉中總黃酮清除羥基自由基能力和DPPH自由基清除率進行測定，發現長柱金花茶提取液濃度在0.10～1.0 mg/mL時，樣品溶液對羥基自由基的清除率隨著濃度的增加而提高；當提取液濃度在0.05～0.25 mg/mL時，隨著樣品濃度的增大，其對DPPH自由基的清除率逐漸提高至50%，清除效果比較明顯。可見，黃酮類化合物可以有效清除體內自由基，表明金花茶黃酮類化合物具有開發成保健品的潛質。

2.2 降血糖功能

全世界患有糖尿病的人數日益增多，我國每年在糖尿病上的醫藥投入非常高昂，該疾病困擾了很多人，醫療機構正通過各種途徑尋找和開發治療糖尿病的藥物。李丹等［33］研究發現一些中藥能夠達到降低人體血糖濃度的功效，并對糖尿病并發癥產生抑制作用，如可以促使胰島素分泌、清除自由基及影響相關蛋白的表達等。關于金花茶黃酮類化合物在降血糖方面的功效，Wang等［6］結果表明，金花茶黃酮類化合物能影響糖類轉化，起到抑制血糖升高的作用；此外，黃酮類化合物對糖尿病并發癥也有一定效果，該研究為開發金花茶中黃酮類化合物、生產降血糖藥品提供了理論基礎。

2.3 抗癌功能

黃酮類化合物抗氧化活性的功效是其抗癌作用的基礎，黃酮類化合物能有效清除、抑制脂質細胞周圍的自由基，從而降低自由基引起的脂質過氧化程度，同時還可以起到預防細胞結構遭到破壞的作用。賽米熱·艾尼瓦爾［7］采用噻唑藍（MTT）比色法，檢測不同濃度高良姜中總黃酮對宮頸癌SiHa細胞存活的影響，發現總黃酮濃度在50～100 μg/mL時可引起SiHa細胞凋亡，研究還發現總黃酮能夠抑制宮頸癌細胞的增殖、誘導細胞凋亡，其作用有劑量和時間依賴性。楊懋勛［8］發現野生白木香中5種黃酮類化合物對人前列腺癌細胞株DU145、PC-3及人肝癌細胞株HepG2顯示抑制活性。因黃酮類化合物具有多樣性，不同黃酮類化合物結構在抗癌方面的機理及功效各不相同，有待深入研究。

2.4 抗腫瘤功能

黃酮類化合物具有抗腫瘤作用，其主要機理有減緩腫瘤細胞增殖進程、促使腫瘤細胞衰亡、影響相關細胞信號轉導中一些酶類活性等［9］。農彩麗等［34］試驗表明，金花茶黃酮類化合物在體外對人體4種腫瘤細胞，即人肝癌細胞株（SMMC-7721）、人高分化鼻咽癌細胞株（CNE-1）、人胃腺癌細胞株（SGC-7901）、人大細胞肺癌細胞株（H460）的增殖都有抑制效果，而且表現出劑量依賴關系。Peng等［4］從金花茶茶花的提取物中分離得到一種新的酰化類黃酮糖苷，即槲皮素7-O-（6″-O-E-咖啡酰）-β-D-吡喃葡萄糖苷，該物質不僅能抑制人體淋巴瘤細胞增殖，還能誘發人體淋巴瘤細胞凋亡。趙元華等［35］研究發現，金花茶不僅葉和花具有抗腫瘤作用，種子也同樣有效，即金花茶整個植株不同部位所含黃酮類化合物都可以起到抗腫瘤效果，開發價值較大。

2.5 其他功能

除了以上諸多功能外，黃酮類化合物還具有其他多種功能，如在抗菌、抗炎、增強人體免疫功能、治療骨質疏松、預防動脈粥樣硬化等方面也都有功效［10］，這些功能主要基于其強抗氧化性和螯合能力等，具體表現為黃酮類化合物可以清除自由基、螯合金屬離子等。關于金花茶黃酮類化合物對人體骨骼增殖的作用方面，劉陽陽等［36］研究顯示其可以促進人體骨骼肌細胞C2C12的增殖分化，具體促進增殖機制可能與金花茶黃酮類化合物抑制NF-kB表達有關。

3 金花茶黃酮類化合物的提取方法

3.1 水提法

水提法也稱為“煎煮法”，是傳統的植物成分提取方法，即把植物材料加水后煮，待充分浸出后取其汁，該方法優點是設備簡單、操作容易、成本較低，缺點是只能提取水溶性的黃酮類化合物，黃酮得率和含量都較低。寧恩創等［2］采用熱水浸提方法結合有機溶劑除雜，對金花茶新鮮葉片中的總黃酮化合物進行了提取，結果顯示總黃酮提取得率為0.19%。羅新星等［37］通過水提法3次提取金花茶葉片水提物，并結合冷凍干燥技術獲得金花茶葉片水提物粉末，檢測到金花茶葉片中主要活性成分黃酮類含量為12.99%。水提法作為一種傳統的提取方法，其提取率不高，如需較高提取率，還要結合其他方法才能達到預期。

3.2 有機溶劑提取法

有機溶劑提取黃酮類化合物的方法是目前應用最為廣泛的一種方法，常用提取溶劑有甲醇、乙醇、乙醚等，該方法對脂溶性基團占優勢的黃酮類化合物而言提取效果較好。有機溶劑提取法的優勢是對設備要求不高、產品得率高、總體成本低，缺點是雜質含量高、提取物純度低［13］。蘇建睦等［38］采用70%乙醇對金花茶茶花中的黃酮類化合物進行提取，經過2 h水浴回流提取，最后得到普通金花茶、毛瓣金花茶及扶綏中東金花茶花中總黃酮含量分別為4.80%、13.78%、6.12%。周潔潔［32］研究認為，長柱金花茶葉中總黃酮最佳提取條件為95%乙醇、料液1∶40、提取溫度40℃、提取3次、每次提取時間2 h，其總黃酮含量為57.5 mg/g。王坤等［39］采用70%乙醇對金花茶葉片中的黃酮類化合物進行提取，結果顯示普通金花茶、顯脈金花茶、凹脈金花茶及小花金花茶葉片中總黃酮含量分別為4.39%、6.12%、13.44%、4.56%。在采用有機溶劑提取法時，需要注意溶劑的選擇，不同有機溶劑對黃酮類化合物的提取效果存在差異；選定有機溶劑后，溶劑濃度、提取溫度、提取時間都影響到金花茶黃酮類化合物的提取率，因此需篩選、優化提取方法。

3.3 超聲波輔助提取法

近年來，超聲波輔助提取法逐漸應用于黃酮類化合物的提取，其原理主要是利用超聲波的能量使細胞膜破裂，促進細胞內化合物釋放、溶出，同時超聲波還會產生機械振動、擴散、擊碎等效應，這將進一步加速細胞內物質的釋放［14］。超聲波輔助提取法的優點是效率高、操作簡單、應用范圍廣，缺點是提取過程噪音大。李石容等［17］研究表明，在20%乙醇、料液比1∶45、溫度70℃、超聲功率300 W、提取1次的工藝條件下，金花茶花中黃酮類化合物的提取效果最佳、得率高達13.7%，高于非超聲波提取的對照試驗（得率9.89%）；該研究還比較了不同超聲功率（200、250、300、350、400 W）對金花茶花黃酮類化合物得率的影響，在料液比1∶50、乙醇濃度20%、提取溫度60℃的條件下，當提取功率在200～400 W時，金花茶花黃酮類化合物得率隨著提取功率的增大先后降低，功率為300 W時達最大值12.7%。牛廣俊等［40］使用層次分析法對金花茶超聲波提取工藝進行了評價，認為該方法可以節約提取時間，總黃酮提取率高（15.88%）。超聲波輔助提取法需要與其他方法結合使用，超聲功率大小設定直接影響提取結果，需經過多次試驗確定最佳工藝。

3.4 酶解法

酶解法是指在植物黃酮類化合物提取中加入適當酶，促使其發生酶解反應，從而使得黃酮提取率更高。植物中的許多黃酮類化合物存在于植物細胞內，被纖維素細胞壁所包圍，若加入纖維素酶，即通過酶解反應促進細胞壁破壞，減少黃酮類化合物提取的阻力，有利于其充分提取；此外，酶解反應在常溫下即可發生，這樣有助于黃酮類化合物結構的保護，避免了高溫破壞［15］。金花茶葉片表面蠟質化、葉脈多、組織緊密，秦小明等［41］在金花茶鮮葉黃酮類等物質提取過程中加入了果膠酶，促使其發生酶解反應，結果表明金花茶總黃酮含量為鮮葉的0.46%、提取率達80.2%。酶解法優勢明顯，比一般方法的提取率高，提取時間也較短，有助于金花茶黃酮類化合物的高效提取。

4 金花茶黃酮類化合物的分離純化方法

4.1 大孔樹脂吸附法

大孔樹脂是一種人工合成的有機高分子聚合物吸附劑，其典型特點是具有立體孔結構，主要應用于植物天然產物成分的分離純化。大孔樹脂吸附法的優點是吸附量大、選擇性好、再生容易等［16］。大孔樹脂有不同型號，實際應用中需根據分離純化目的和樣品性質來選擇型號。湛志華等［42］在金花茶葉片黃酮類化合物的分離純化過程采用了D-101大孔樹脂吸附方法，結合75%乙醇洗脫、旋干，得到金花茶粗黃酮，再用無水酒精精制獲得精制黃酮，黃酮粗品中總黃酮含量為2.33%，黃酮精品中總黃酮含量為4.62%。寧恩創等［5］則采用XAD-16大孔吸附樹脂對金花茶粗黃酮進行分離，獲得分離后的組分F1、F2、F3；該研究發現使用大孔樹脂作為分離介質，再經過乙醇洗脫劑，可實現金花茶黃酮的有效分離，黃酮總得率接近70%，烘干后組分F2及F3中黃酮含量均達70%以上。可見，大孔樹脂吸附法在金花茶黃酮類化合物的分離純化中效果明顯，但該方法需要配合其他試劑和操作（如乙醇洗脫）才能實現最終分離純化目的。

4.2 色譜法

色譜分離法主要原理是利用分離物在不同固液相之間流動速度的不同而達到分離目的。該法目前在生物、醫藥及食品等領域的研究過程應用廣泛，常見的色譜法包括柱色譜、薄層色譜、氣相色譜、高效液相色譜等［17］。黃艷等［28］采用薄層硅膠柱分離、薄層色譜鑒別及重結晶等方法分離顯脈金花茶的提取物，得到山萘酚等7個單體化合物。鄒登峰等［43］研究建立了金花茶葉黃酮類成分的高效液相色譜指紋圖譜，該研究者在對金花茶黃酮類化合物提取的另一項研究中，通過硅膠柱色譜和半制備液相色譜分離得到4種化合物，其中包括蘆丁和芹菜素6,8-二-C-β-吡喃葡萄糖苷［30］。陳秋虹等［44］運用硅膠柱色譜、薄層色譜及高效液相色譜相結合技術，分離純化得到長柱金花茶的多種黃酮物質。色譜法能有效分離金花茶中的黃酮類化合物，研究者一般將多種色譜法結合使用，從而達到更好的分離效果。

4.3 膜分離法

膜分離技術的原理是應用人工合成的高分子膜，根據其兩側濃度差、壓力差等實現對物質的分離和純化，現有膜分離方法主要有微濾、納濾、超濾、反滲透等，目前濾膜材料品種不多，仍需進一步開發［18-19］。楊繼住等［45］研究認為，在納濾濃縮過程中，膜的滲透通量隨操作壓力和溫度的上升而加大，隨濃縮時間的延長而減小，最終能實現對金花茶提取液中黃酮類物質的富集；該研究者認為，在簡化工藝、縮短周期及節能方面，納濾分離技術要比傳統真空濃縮技術更具優勢。迄今，在金花茶黃酮類化合物的分離中，膜分離技術還未被廣泛應用，可能是膜材料品種較少所致，未來隨著膜材料的逐漸豐富，該技術也會更多地應用在實際中。

5 金花茶黃酮類化合物的測定方法

5.1 分光光度法

分光光度法的基本原理是以蘆丁為標準品，Al（NO3）3絡合體系顯色，一般在510 nm處有最大吸收峰，通過測定其吸光度，計算出其中的總黃酮含量。該方法雖然容易受到處理過程顏色變化的影響而產生測量誤差，但仍是最常用的總黃酮含量測定方法，原因是該方法操作簡單、測定成本低、儀器要求不高［20］。黃興賢等［46］采用分光光度法對14種金花茶葉片中的總黃酮含量進行了測定，研究發現，蘋果金花茶中總黃酮含量最高、為22.011%；普通金花茶新葉、一年葉、兩年葉中總黃酮含量分別為10.145%、3.079%、2.290%，即新生葉中總黃酮含量明顯高于老葉。羅新星等［37］也采用分光光度法測定了金花茶葉水提物中總黃酮的含量，所測黃酮活性成分含量為12.99%。分光光度法由于測定方法簡單、成本低等優點，目前應用較為廣泛，但是該方法精確度不高，僅能測定總黃酮含量，對精確度要求較高的則需要考慮結合其他方法。

5.2 高效液相色譜法

高效液相色譜法是以經典的液相色譜為基礎，以液體為流動相，采用高壓輸液系統，將具有不同極性的單一溶劑或混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內被分離后再進行檢測，從而實現對樣品的分析，高效液相色譜是測定黃酮類化合物的有效方法，效率較高［21-23］。周興文等［47］采用高效液相色譜法，對不同發育時期金花茶花瓣中的櫟精-7-O-β-D-葡萄糖苷、櫟精-3-O-β-D-葡萄糖苷和槲皮素等3種黃酮類物質的絕對含量進行測定，發現3種成分含量均表現為先上升后下降，最大值分別達到1228.6682、228.1467、2.9361 μg/g。牛廣俊等［48］采用高效液相色譜法對19種金花茶葉片中的黃酮含量進行測定，發現不同品種金花茶葉片中黃酮含量差異顯著，證實了不同品種金花茶葉在品質上存在較大差異。高效液相色譜法在金花茶黃酮類化合物的測定上精確性明顯較高，可以具體到其中一種黃酮化合物含量的測定。

5.3 液相色譜與質譜聯用法

液相色譜與質譜儀是液相色譜與質譜的聯用，將兩者的優勢相結合，是一種高端分析儀器。液相色譜能夠將樣品中的成分有效分離，質譜則可以對分離出的成分逐個分析，得到其分子量、濃度甚至結構等信息。液相色譜與質譜聯用法已成為當前最為精確的一種測定方法，與其他方法相比，其能達到更佳的選擇性和更低的檢測限，對黃酮類化合物的分析具有較高的靈敏度，而且耗時較短［24］。梁香等［31］采用液相色譜與質譜聯用方法，檢測到金花茶中黃酮類物質主要為槲皮素和山柰酚，總黃酮含量達3.0%，認為該方法測定金花茶中黃酮類化合物效果較好，適于金花茶黃酮類成分的分析檢測。液相色譜-質譜儀器較為高端，分離測定效果明顯優于其他方法，在今后應用中潛力巨大。

6 展望

金花茶中黃酮類化合物是一類重要的天然產物，金花茶也因含有大量且多樣化的黃酮類化合物而逐漸引起人們重視。近10年來，研究者們積極探究如何從金花茶中提取純度高、活性強的天然黃酮類化合物成分，并試圖通過各種技術方法，如超高效液相色譜與質譜連用技術，實現定性定量分析金花茶中黃酮類化合物成分和含量，并已檢測到數十種黃酮類成分，但對檢測出的每一種黃酮類化合物的具體生物學功能機理方面的研究，目前仍較為缺乏，現有研究主要是針對金花茶中總黃酮類化合物生物學功能的報道，因此，今后研究中有必要加強對各種黃酮類化合物的生物學功能研究。

金花茶是我國珍稀瀕危保護物種，現存金花茶原生種質資源40余種，當前關于金花茶中黃酮類化合物的研究主要以普通金花茶、毛瓣金花茶、凹脈金花茶、顯脈金花茶等常規栽培種為主，仍有許多金花茶種質資源未見報道，未來可擴大研究范圍。不同品種的金花茶，其黃酮類化合物的成分及含量也不盡相同，只有通過對多種金花茶進行研究，才能篩選出開發價值較高的品種。此外，如何將提取出來的金花茶黃酮類化合物進一步加工成有抗氧化、抗腫瘤、抗癌等功能的醫藥、保健及食品等，即深加工技術也是今后研究的一個方向，市場上關于金花茶黃酮類化合物的產品還較少，具有良好開發潛力。