ATP熒光法在衛生領域的應用及局限性

張 博，劉 陽，李大玉，陳 玉，趙小梨

（遵義醫科大學，貴州遵義 563000）

ATP熒光快速檢測細菌總數的方法近些年被廣泛應用在各個行業。國內有些乳品廠的品控部門已經將該法作為奶站原料奶收集的判斷標準；應用該方法的物表檢測試劑也在各個衛生監督部門廣泛使用，大大提高了餐飲等衛生行業監督的效率[1-3]。但該方法目前仍沒有取代平皿法寫入國家標準方法中，而且也沒有統一的行業標準，只有個別企業內部根據實際情況或部分市縣局衛生監督部門根據各自地區的衛生情況自行設定的檢測標準[4]。

目前，一些省市級衛生監督部門已經采購了熒光試劑和配套的熒光檢測儀。在日常工作中相關衛生部門通常會采用該方法在大型群體活動中使用，比如在省市的運動會中對餐飲具的衛生實時監控，不僅保障了食品衛生的安全，而且一旦出現細菌總數超標的情況，可以第一時間排查細菌的污染源頭。但因沒有國家標準，很難根據檢查的結果進行相應的判罰，所以衛生監管部門一般只在應急活動中使用。而熒光法在歐美等國家的應用較國內則更為普遍，因該方法可以實時快速地提供半定量的結果，使許多食品企業將此方法作為企業內部的質控標準，大大提高了工作效率，保障了產品的衛生質量。不僅如此，因價格相對便宜、操作簡單，普通百姓也將此方法應用在日常生活中。

1 熒光法反應原理的優勢和局限

1.1 ATP熒光法較平皿法有不可比擬的優勢

首先，該方法的原理是利用去污劑裂解細菌的細胞壁，從而釋放細菌中的ATP，通過螢火蟲熒光素酶催化反應將化學能轉化成光能，光能又會通過光路放大轉化成電信號，通過儀器直接讀出檢測結果[5]。從ATP的釋放到酶促反應的完成，最終由儀器顯示檢測的結果，整個過程不超過5min。平皿法采樣前期不僅準備工作繁瑣，而且細菌培養耗時、平皿生長菌落數難以把控，以上問題通過ATP熒光法都可以很好解決。所以，ATP熒光法的操作流程和工作效率等方面相對平皿法都有較大優勢和更廣闊的應用前景。

1.2 ATP生物檢測所面臨的問題

ATP熒光法屬于生物檢測試劑，優點是反應快速，但幾乎所有生化反應均需要解決的就是生物試劑的活力問題。該方法反應的基礎是酶促反應，而反應中的核心物質——螢火蟲熒光素酶的活力對整個檢測結果起到至關重要的作用。該酶對熱溫度敏感，溫度超過25℃會對酶的活力造成不可逆轉的損傷[6]。一旦反應中酶的活力降低，將直接導致檢測結果比實際值偏低，如高溫時間過長甚至導致酶活力全部喪失，檢測結果為零。目前，市場上銷售和使用的檢測試劑因夏季炎熱大都需要攜帶冰盒和冰袋進行低溫保存，攜帶不便，如遇環境高溫過久，冰袋融化較快，即使攜帶保溫設備，實際檢測中仍會造成檢測結果偏低。如果通過冷凍干燥的方法將試劑制成干粉狀來提高試劑的穩定性，將大大提高該方法的應用范圍[7]。

1.3 ATP熒光法仍然沒有取代平皿法成為檢測細菌總數的國家標準方法

ATP熒光法應用甚廣為何遲遲沒有取代或是補充到國家標準檢測方法中，主要是此法的檢測結果缺少統一的標準，而標準結果的制定又與試劑和儀器2個方面有關。

首先，因為此法的基本原理是酶促反應，單位時間內，相同底物濃度的反應速度與酶（螢火蟲熒光素酶）的濃度及活性相關，酶的濃度及活性越高，反應速度越快，而在相同的檢測時間內，酶活及酶含量高的試劑檢測到的光產物則越高[8]。目前，市場上有多家公司在銷售不同品牌的ATP熒光檢測試劑，但行業內和國家并沒有規定試劑中酶的濃度和比活力，所以有時會造成試劑靈敏度不同，檢測結果偏差很大。

其次，該方法的直接產物是光，將光信號轉化成電信號則需要特殊的光學部件來完成。不同的儀器對光子轉化的原理有很大的不同，靈敏度最高的是以光電倍增管為核心原件的一類儀器，該類儀器靈敏度高，但體積稍大、不方便攜帶，且儀器成本高[9]；另一類是以光電池為原件的儀器，靈敏度較光電倍增管低幾個數量級，但體積小、成本低，便于攜帶及普及應用[10]。同樣，目前并沒有相關部門明文規定要使用哪一類型的儀器作為標準儀器。基于對檢測結果影響最為關鍵的試劑和儀器2個因素均存在不確定性，短時間內很難制定出國家統一的標準。因此只有在試劑的靈敏度、儀器的型號、檢測的方法和流程細化后，才能使該方法成為細菌檢測的國家標準方法提供可能性。

2 目前ATP熒光法市場應用及存在的問題

2.1 牛奶檢測

ATP熒光法應用最多的當屬乳品行業，因為該方法的優勢在乳品行業得到了充分的體現。首先，牛奶屬于營養富集品，細菌在牛奶中的生長為20 min一代，用國標平皿法需48 h才可以得出檢測結果，檢測之前沒有菌落超標的樣品已經超標，之前細菌超標的已經變質。所以平皿法對牛奶中細菌檢測是完全滯后的。因平皿法檢測流程繁瑣，乳品企業在收集不同奶站的牛奶時，無法實時檢測，往往因個別牛奶細菌總數超標造成整罐牛奶變質而造成巨大損失。如果冒然將未知檢測結果的牛奶提前進行銷售，一旦質量出現問題，對人體健康和品牌效應的影響則更無法估量。因此ATP熒光法的實時檢測可以很好地彌補平皿法的缺陷。其次，牛奶中細菌總數較多，國標法要求牛奶中每毫升細菌總數不得超過2×106CFU/g（mL），對檢測結果的靈敏度和精確度要求不高，雖然ATP熒光法不能與平皿法檢測的結果一一對應，但2種方法有一定的相關性，相關系數可達0.98，所以ATP熒光法在乳品行業的應用更有價值[11]。

鮮牛奶中含有一定量游離的ATP，會對檢測結果造成影響，而且牛奶體細胞中同樣含有大量的ATP，當使用細菌裂解液裂解細菌細胞壁時，體細胞也會被裂解開，釋放出的ATP同樣對檢測結果有影響。目前的方法是通過一次性無菌的濾膜，孔徑為0.45 μm，可以截留98%的細菌和體細胞，通過PBS緩沖液沖洗掉游離的ATP，再通過體細胞裂解液裂解體細胞并釋放ATP，同樣通過緩沖液去掉體細胞釋放的ATP。通過上述方法排除游離的ATP和體細胞中ATP的干擾。最后，通過細菌裂解液釋放濾膜截留細菌的ATP并檢測相對發光值（RLU）。但該方法也有其自身的局限性，因牛奶為高蛋白的營養物質，放置過久牛奶中的蛋白質會聚集沉淀出來，加壓過濾去掉游離和體細胞中的ATP時，沉淀的蛋白質會導致濾膜的堵塞，從而無法排除體細胞中ATP的干擾，導致檢測結果不準確。而且乳品企業每日檢測的樣品較多，如果全部檢測成本過高也是現實中存在的問題。

2.2 物體表面清潔度的檢測

ATP熒光法在物體表面潔凈度檢測方面的使用最為廣泛，物表檢測因其采樣的方法[12]、物體表面的粗糙及處理情況不同等原因，檢測的結果與平皿法的結果相關性沒有與牛奶檢測結果的相關性好。但作為半定量的一種監控方式則非常實用，比如對衛生要求比較嚴格的環境，如醫院、食品生產車間等，近些年已經有大量的醫護工作者應用該方法對醫院的托盤、護士雙手、電梯、衛生間等各個方面進行分析[13-15]。還有對手術器械等嚴格消毒的樣品進行分析，但此時對試劑的靈敏度及抗干擾能力則要求更高。該方法也經常被用在餐飲部門的餐飲具潔凈度檢測中，有些清潔過的餐飲具如長時間放置也會滋生細菌，如果衛生部門通過實時的方法當場檢查，當場給出檢測結果，并進行相應的懲處，則對餐飲行業的威懾力非常大，對餐飲商家的自律起到不可估量的影響。因為物表細菌檢測的特殊性，ATP熒光法很難與國標平皿法進行定量比較，但可以根據大量檢測數據給出半定量的檢測限，通過檢測結果并結合各行業自身的衛生要求自行設定合格、警告、不合格等檢測標準[4]。

2.3 飲用水的檢測

ATP熒光法檢測水中細菌總數的結果與國標平皿法結果的相關性相對于牛奶和物表的更高，但實際應用卻較少。因為日常生活飲用水都進行過消毒，細菌較少，加之水中營養缺少，細菌不易滋生，正常城市生活飲用水細菌超標的情況較少，細菌超標多是發生在直接飲用地下水的偏僻地區或被工廠廢水污染的周邊地區。此時應用該方法可以第一時間排查污染源頭，防止事態進一步擴大[16-17]。目前檢測水應用較多的是游泳池、自來水廠、啤酒廠等[18]。

2.4 科研領域

ATP熒光法也被應用在科研領域中，ATP是所有生物的能量物質，也是能量轉換的基本單位，檢測能量物質ATP的增加和減少則可以反映生命活動進行的程度[19]。體內能量物質的代謝大都由酶來催化完成，而以核酸為底物的聚合酶促反應則由ATP水解提供能量，測定反應前后ATP含量的變化可以間接反映酶促反應進行的程度。因為減少了細菌裂解等前處理步驟，ATP作為底物直接參加酶促反應，所以檢測的結果更為準確，有多種根據此原理開發的ATP檢測試劑盒被應用在科研領域中。在農業方面，楊國棟，劉杰等人[20-21]也通過該方法檢測土壤中微生物的含量來監測土壤質量等相關指標。

2.5 特異菌的檢測

ATP熒光法檢測細菌總數的理論基礎之一就是不同的細菌中所含的ATP含量大致相等。通過ATP含量測定推測出細菌的總體數量。但有些方面需要檢測特異菌的存在或數量。目前，市場上絕大多數的試劑都是檢測細菌總數，但如果想讓該方法應用更為廣泛，特異菌的檢測必不可少[22]。目前已經有檢測特異細菌的熒光試劑上市，一般是通過免疫法富集目的特異細菌，再通過沖洗非特異細菌來排除其他細菌干擾[23]。但日常檢測要求致病微生物不得檢出，此時對該方法的靈敏度則是非常大的挑戰。目前的熒光試劑檢測個位數的特異菌仍有很大困難。

3 結語

ATP熒光法在歐美國家已經被發現、采用、應用了許多年，2010年之前市場上銷售的絕大多數為進口試劑，價格昂貴，在企業內部難以普及使用，近些年，國產的熒光試劑和配套的檢測儀器大量涌現，但基于試劑、儀器和細化的操作流程等諸多因素，導致仍沒有形成國家級的檢測標準，使該方法不能通過行政手段快速普及和使用。雖然國產的熒光試劑相比進口試劑便宜許多，但單次的檢測成本仍是平皿法的10倍以上，價格也是導致該方法普及使用推進緩慢的因素之一。其次，許多樣品都需要特殊的前處理，比如化妝品中細菌數量極少，膏狀物又不能通過濃縮進行細菌富集，仍需要3～5 h在37℃進行擴增培養[24-25]；干粉中的細菌多為孢子，目前的裂解液很難將其徹底裂解，導致ATP釋放不完全，同樣需要將樣品進行前處理[26-28]；檢測肉制品的細菌總數時，剪碎或研磨的樣品無法通過半透膜去除游離的ATP等[29]。

首先，如果可以降低該方法的檢測成本，并將不同類別樣品的前處理的細節做得更好，即使沒有國家級的標準出臺，該方法作為企業內部產品質控標準也不失為一種理想的方法；其次，如何加深產品實時監控的理念也尤為重要，目前許多企業通過HACCP很好地控制了產品的生產過程，ATP熒光法就是很多相關企業實施過程監控的有效手段之一；最后，相關部門也應完善產品召回的制度，加大不合格產品的懲罰措施，防止有些企業存在僥幸心理，放松產品生產過程監控。