細菌外膜囊泡與抗生素相關的研究進展

程謙 吳疆 王岱

(廈門大學分子疫苗學和分子診斷學國家重點實驗室，廈門 361102)

革蘭陰性菌細胞膜包含大量的蛋白質，有著重要功能，如營養獲取、黏附、分泌、信號傳遞和應對環境壓力等，細胞膜的破壞對于細菌來說是致命的。為了適應環境，革蘭陰性菌進化出了一種在不破壞細胞膜情況下也能分泌出來的來源于細胞膜的球狀小泡，其中含有DNA、RNA、周質蛋白、毒力因子，病原相關分子模式(PAMPs)和其他外膜成分。由于其通常來源于細菌外膜，故又稱為細菌外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)[1-2]。細菌外膜囊泡既不同于傳統的分泌系統，也不同于細胞裂解及凋亡的產物。越來越多的研究者開始將細菌外膜囊泡視為一種新的分泌系統，認為其能介導細菌中蛋白質、磷脂和核酸等生物大分子的轉運，從而導致毒力和致病能力的提高、影響宿主的生理病理過程[2]。病原微生物與感染性疾病嚴重威脅人類健康，目前抗生素依然是感染性疾病治療的主要手段。有研究表明抗生素可以影響細菌外膜囊泡的合成及分泌，反過來外膜囊泡對細菌在抗生素環境下的存活、耐藥性的獲得等也有作用。但是國內關于此方面的報道不多。故本文從細菌外膜囊泡與抗生素的角度出發，對細菌外膜囊泡這種新的分泌系統、抗生素對細菌外膜囊泡影響及細菌外膜囊泡應用等方面進行綜述，以期對后續研究提供幫助。

1 細菌外膜囊泡

病原微生物嚴重威脅人類健康，一部分原因在于原核生物進化出了各種各樣巧妙的分泌途徑來幫助其完成感染及致病。除了經典的一型到六型分泌系統，細菌在生長過程中能夠不斷地從外膜上產生直徑在20～250nm的外膜囊泡[3]。細菌外膜囊泡是一種新型分泌系統的觀點得到了越來越多的認同。細菌外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)是一種直徑為20～250nm，可通過巨胞飲、小窩蛋白、網格蛋白和脂筏介導的內吞作用運輸至宿主胞內或者胞外特定部位進而發揮生物學作用的活性物質[4]。囊泡運輸途徑相較于其他分泌系統有許多優點：它們可以裝載各種類型的物質，從蛋白類大分子毒素到疏水性小分子；對囊泡內裝載物有一定保護作用；并且囊泡運輸途徑可以實現其他分泌系統難以做到的長距運輸[5]。

1.1 細菌外膜囊泡的產生

電子顯微鏡的出現使得細菌超微結構的研究得以展開。自從1963年與1965年的報道顯示革蘭陰性菌囊泡的存在，越來越多的研究表明革蘭陰性菌分泌囊泡狀物質是一種普遍現象[6-9]。細菌外膜囊泡是球狀膜囊泡，其形成過程與細胞應激密切相關(例如暴露于抗生素壓力下)。目前國際上關于細菌外膜囊泡形成機制有幾種解釋，包括局部膜重塑，脂多糖、肽聚糖及周質空間膨壓的改變。最早之前，Burdett等[10]和Hoekstra等[11]關于OMVs生物發生的研究表明，肽聚糖(PG)和細菌外膜之間交聯的減少引發它們的形成。Mashburn等[12]提出當細菌外膜磷脂，脂多糖和其他特定分子富集時細菌外膜的曲率變化導致OMVs產生。在銅綠假單胞菌上完成的工作揭示了由群體感應分子PQS插入細菌外膜后會導致OMVs產生[13-14]。其他像正電荷化合物、螯合劑EDTA、改變外膜蛋白穩定性還有高溫、抗生素壓力等環境因素也會導致OMVs的產生[1,15-17]。這些模型的共同假設是OMVs從外膜區域突出，肽聚糖與外膜之間交聯的破壞或者膨壓的增加導致外膜與肽聚糖層的解離。

1.2 細菌外膜囊泡的組成

由于細菌種類的不同以及細菌各自生態區位的差異，其外膜囊泡也展示出了不同的組成。雖然普遍認為細菌外膜囊泡來源于外膜和周質而不是內膜或細胞質，但越來越多的證據表明OMVs中攜帶脂多糖(LPS)、磷脂、肽聚糖、外膜蛋白(OMPs)、細胞壁、蛋白質(周質、蛋白質和膜結合)、核酸(DNA和RNA)等成分，并且OMVs除了經典的直徑20～200nm不等的球狀結構外，在其他細菌中還發現了管狀和細長型結構[18-19]。隨著蛋白質組學分析技術的進步，在OMVs中已經鑒定出了很多屬于不同的功能類別蛋白質[20]，例如大腸埃希菌MG1655中就鑒定出了幾百種蛋白質其中包括一些蛋白酶和肽酶。Horstman等[21]報道甘油磷脂，磷脂酰甘油，磷脂酰乙醇胺和雙磷脂酰甘油是產腸毒素大腸埃希菌OMVs中主要脂質，其與OMVs的曲率相關。也有報道稱OMVs中存在一些不是細菌外膜成分的脂質[22]。除了蛋白質及脂質成分，外膜囊泡腔和表面還攜帶相關的DNA和RNA，比如質粒和噬菌體DNA。但核酸摻入OMVs的實際機制仍不清楚，有研究者猜測核酸可能是細菌裂解殘留物摻入OMVs中隨機帶入，也有一些學者認為其生物發生過程并不是偶然[23-24]。

1.3 示蹤OMVs運輸途徑的研究方法

目前已經知道的OMVs進入宿主細胞的途徑有巨胞飲、小窩蛋白、網格蛋白和脂筏介導的內吞作用等[25]。但是探究OMVs進入宿主細胞后具體的作用靶標及信號通路依然是一個難題。為了找到一種快速高效的追蹤囊泡傳遞效應物的方法，研究者們進行了很多嘗試。Bauman等[26-28]研究者利用染料對外膜囊泡進行標記，這種染料可以實時顯示OMVs進入宿主細胞、傳遞裝載物質的過程，但這些染料也可能改變囊泡成分及生化特征導致實驗誤差。Martina等[29]研究者利用免疫學方法標記與OMVs相關表位，這種方法特異性很好，但需實驗前先將細胞進行固定并且純化OMVs相關抗體。Kaparakis等[30-31]研究者利用宿主細胞表型上的特異性改變作為囊泡運輸毒素進入胞內的一種指示。這種方法僅適用囊泡進入細胞后有能觀測到明顯的標志性特征。最近，O'Donoghue研究團隊[32]提出了一種以囊泡靶向探針為導向的高靈敏度實時探究囊泡進入宿主細胞動力學的方法。他們發現細菌細胞壁的組成會影響囊泡的攝取途徑以及后續的進入動力學和攝取效率，并且脂多糖O抗原的存在使囊泡可以繞過網格蛋白介導的內吞從而提高它們進入宿主的效率。這些快速高效的研究囊泡進入宿主并傳遞效應物的方法是后續研究OMVs對宿主相關影響的基礎。

2 細菌外膜囊泡與抗生素

OMVs已被證明含有一系列膜相關蛋白，周質蛋白和細胞質成分，涉及重要的生物功能，包括信號傳導、應激反應、群體感應和毒力。越來越多的研究表明細菌外膜囊泡與抗生素之間密切相關。并且，抗生素治療引起的氧化應激反應及細菌外膜囊泡的產生有可能導致機體細菌感染的加重。

2.1 抗生素壓力刺激OMVs的分泌

抗生素壓力刺激可以調節OMVs的產生。腸出血性大腸埃希菌易造成嚴重的細菌感染并引發危及生命的溶血性尿毒綜合征。研究表明，環丙沙星，美羅培南，磷霉素和多黏菌素B能刺激腸出血性大腸埃希菌O104:H4和O157:H7中外膜囊泡的產生，并且環丙沙星還能上調OMVs中腸出血型大腸埃希菌主要毒力因子志賀毒素2a的產生。這些作用可能會惡化臨床上產志賀毒素大腸埃希菌造成的感染[33]。研究者的數據同時進一步支持了現有“應避免抗生素治療此類致病菌感染”的建議。隨著對常用抗生素頭孢菌素和碳青霉烯類耐藥的菌株的流行率增加，疾病的負擔和復雜性也隨著增加。

因此，必須了解致病菌感染發病機制及抗生素耐藥機制，以獲得替代的干預策略。慶大霉素是一種重要的抗生素，常與其他抗生素聯合用于治療嚴重的敗血癥。還有研究者探究了臨床上相關的應激誘導條件下腸外致病性大腸埃希菌臨床分離株促炎性外膜囊泡的產生和組成，發現當慶大霉素敏感菌株暴露于一系列不同濃度慶大霉素時，其外膜囊泡顆粒豐度有了增加；相反，在慶大霉素抗性菌株中則沒有觀察到增加。可以說，OMVs的產生是革蘭陰性細菌應激反應的一部分，用來提高細菌在抗生素環境壓力下的存活能力[34]。

2.1.1 抗生素處理引起的細菌包膜應激

抗生素處理引起細胞被膜壓力增加，例如研究者Kadurugamuwa等[35]發現多黏菌素和慶大霉素可以通過外膜的起泡而促進外膜囊泡形成，研究者Manning等[36]也證明了OMVs可以作為中和噬菌體和膜靶向抗生素的誘餌，從而幫助細菌細胞抵抗抗生素壓力。同樣，在銅綠假單胞菌中也發現慶大霉素能夠結合并破壞銅綠假單胞菌的細菌外膜，從而導致OMVs的釋放[37]。

2.1.2 抗生素處理引起的SOS應答

抗生素治療有時候會因為誘導SOS反應和促進細菌的囊泡增加從而加重細菌感染。SOS反應是一種通過轉錄水平的應答[38]，當使用引起DNA損傷型抗生素特別是喹諾酮類藥物如環丙沙星處理細菌時通常會引起SOS反應。SOS反應又可以觸發由前噬菌體編碼的內溶素的表達，從而引起裂解刺激囊泡形成。例如銅綠假單胞菌會通過SOS響應來刺激外膜囊泡的產生[39]。研究者Maredia等[40]發現喹諾酮類藥物環丙沙星刺激下的銅綠假單胞外膜囊泡脂質和細胞毒性水平均增加。然而，在無法激活SOS反應的銅綠假單胞缺陷菌株中，環丙沙星應激期間囊泡分泌的增加受到抑制，這表明SOS反應在OMVs生物發生中的重要作用。使用絲裂霉素C處理痢疾志賀菌也會激活其SOS反應，導致志賀毒素相關的OMVs水平增加，毒力增強。并且這種壓力誘導下的囊泡增加也可以促進大腸埃希菌的存活率[41]。有趣的是，環丙沙星誘導分泌的外膜囊泡與亞胺培南誘導的外膜囊泡相比，在形態和蛋白含量方面存在顯著差異。這些研究結果暗示不同類型的抗生素可能誘導產生不同的外膜囊泡。

2.1.3 抗生素抑制細胞壁合成，促進囊泡的形成

β-內酰胺類抗生素可以通過阻斷肽聚糖合成來破壞細胞壁完整性，在細菌肽聚糖層中產生空穴，細胞質膜及內含物可以通過這個空穴突出到細胞外空間從而刺激革蘭陽性細菌細胞質囊泡的形成[3,42]。

2.2 OMVs在抗生素壓力下的保護性

2.2.1 OMVs能與氨基糖苷類抗生素結合

在環境中通常存在著幾種細菌群體共存的情況，研究者使用來自大腸埃希菌MG1655的OMVs處理銅綠假單胞菌及鮑曼不動桿菌，發現其顯示出了膜活性抗生素如黏菌素、蜂毒肽、多黏菌素B處理下的保護性[43]。這種保護是通過隔離或降解膜活性抗菌分子來實現。然而，大腸埃希菌的OMVs不能保護任何這些細菌免于其他抗生素如環丙沙星、鏈霉素和甲氧芐啶的殺傷作用[2,36]。OMVs可以幫助細胞生存的第二種可能機制是通過OMVs的外膜來結合氨基糖苷類抗生素。研究表明，OMVs可以幫助抵抗多黏菌素，因為這種抗生素與OMVs結合后變得不穩定。類似的，暴露于慶大霉素后細菌釋放的OMVs可以通過在OMVs被轉運到胞質溶膠之前脫落上面結合的抗生素來幫助細菌增大存活的機率。釋放的OMVs還可以通過結合或吸收抗生素從而清除外部環境中的抗生素。

2.2.2 OMVs中含有具有活性的酶

早些時候已經發現OMVs中含有β-內酰胺酶，肽酶，蛋白酶和其他裂解酶等[44-47]，這些酶在OMVs中的穩定存在暗示了其在抗生素方面的可能作用。近期對多重耐藥嗜麥芽寡養單胞菌的研究表明，β-內酰胺類抗生素會誘導其分泌更多的囊泡，并且分泌的OMVs被證明可以降解細胞外環境中的β-內酰胺類抗生素[48]。研究者還發現在β-內酰胺抗性大腸埃希菌的OMVs中，幾種可能參與降解β-內酰胺類抗生素的蛋白質含量更高，因此，來自β-內酰胺抗性大腸埃希菌的OMVs可直接和劑量依賴性地降解β-內酰胺抗生素，并使β-內酰胺敏感的大腸埃希菌和其他細菌免受β-內酰胺抗生素引起的生長抑制。這些結果表明來自β-內酰胺類抗性大腸埃希菌的OMVs在β-內酰胺類抗生素敏感細菌的存活中起重要作用。這一發現可能為抗擊當前全球抗生素耐藥性擴散提供一種新思路[49]。

2.2.3 OMVs可以增強藥物外排能力

生物膜是細菌產生的一種具有保護作用的表面黏附結構，其中含有多糖、脂質、核酸、蛋白、鞭毛、菌毛和OMVs等物質。生物膜對細菌的生存以及耐藥性的獲得十分重要。在細菌生物膜中，OMVs是重要的成分。很多研究報道OMVs與銅綠假單胞菌生物膜的關聯[50-52]，可以設想在這種濃縮的OMVs環境中，通過這種基于囊泡作用的機制可以進一步增強微生物生物膜的作用從而幫助細菌抱團抵抗抗生素[1,50-51]。更重要的是，OMVs相關的多種藥物外排泵有助于易感細菌在抗生素環境中的短暫存活。藥物外排泵(efflux pumps)是存在于細菌細胞膜上的一類蛋白質。研究發現，許多細菌可以通過外排泵系統將進入胞內的抗菌藥物泵出胞外，從而使菌體內藥物濃度降低而導致耐藥[53]。在Kim等[49]的研究中，當大腸埃希菌處于抗生素壓力環境下OMVs的產生可以通過去除錯誤折疊的蛋白質、排出抗生素來幫助細胞存活更長時間。細菌外膜囊泡相當于給細菌藥物外排泵提供了一種有利武器。

2.2.4 OMVs介導細菌耐藥性的擴散

核酸的細胞間轉移是細菌進化的固有特征，這種轉移可以通過自然轉化，結合和轉導完成。很早就有研究表明在淋病奈瑟球菌中，含有青霉素抗性基因的質粒被轉移到青霉素敏感的淋球菌中[54]。近些年研究也進一步證實了細菌分泌的納米管及外膜囊泡也能幫助細菌完成耐藥基因的轉移和擴散。例如黏膜炎莫拉菌的OMVs能夠將β-內酰胺酶蛋白轉移到肺炎鏈球菌和流感嗜血菌中，從而促進它們在阿莫西林存在下的存活[55]。鮑曼不動桿菌外膜囊泡中含有編碼β-內酰胺酶的blaOXA-24基因而具有青霉素類和頭孢類抗生素抗性，并且隨著外膜囊泡的排出導致碳青霉烯耐藥的轉移[51]。

3 OMVs在減少抗生素耐藥方向的應用

抗生素耐藥在全球范圍內都是無法忽視的難題，如何延緩抗生素耐藥情況的惡化以及找到新的抗菌途徑是當前研究的熱點。OMVs具有多種生物學和病理生理功能，在抑制細菌疾病復發及抵抗抗生素耐藥方面具有巨大潛力。例如來自擬桿菌的OMVs口服后可以通過腸黏膜屏障到達下面的上皮細胞和巨噬細胞[56]。有研究者提出利用天然衍生的OMVs的生物相容性和固有抗生素藥物載體的特性，將抗生素遞送到感染部位。例如將抗生素摻入納米顆粒藥物載體作為一種增強抗菌效力及克服某些微生物耐藥性作為一種新的藥物開發策略。這種方式可以保護抗生素免于降解并減少副作用，但還需提高其靶向致病菌的選擇特異性。目前利用OMVs的生理特性已經實現了向組織遞送一系列治療性物質(siRNA、microRNA和蛋白質)[57]。除此之外，研究者發現來自黏細菌的OMVs抑制大腸埃希菌的生長與臨床建立的抗生素慶大霉素程度相當，同時液相色譜耦合質譜分析顯示在OMVs中存在抑菌成分。這項工作可以作為進一步評估來自黏細菌的OMVs作為抗細菌感染的新型治療遞送系統的重要基礎[58]。另一方面，因為OMVs對于宿主中細菌的存活及致病是必需的，所以外膜囊泡的調控也可以成為抗生素開發的潛在靶標。

4 展望

細菌外膜囊泡在解決細菌耐藥這一難題方面有巨大潛力。盡管已有很多研究表明OMVs可以保護細菌免受抗生素的傷害，但很少詳細說明其保護的方式和程度。并且對于細菌外膜囊泡與抗生素相關的研究尚未系統化，抗生素進入外膜囊泡的具體機制以及OMVs對細菌的保護性是否具有特異性或偏向性也有待闡明。未來，抗生素、細菌外膜囊泡及生物被膜之間聯系的闡明將有助于破解細菌耐藥性難題。