鏈霉菌抗生素生物合成中的細胞色素P450酶

潘麗霞 朱婧 王青艷 楊登峰

(1 廣西科學院非糧生物質酶解國家重點實驗室 國家非糧生物質能源工程技術研究中心，廣西生物質產業化工程院 廣西生物煉制重點實驗室，南寧 530007；2 廣西科學院廣西北部灣海洋研究中心，廣西海洋天然產物與組合合成生物化學重點實驗室，南寧 530007)

細胞色素P450酶(P450s或者CYPs)是一類依賴于亞鐵血紅素，催化多種復雜氧化反應的多功能酶。它廣泛地存在于各種生物體內，包括細菌，真菌，哺乳動物以及人體。之所以得名P450，是由于在催化過程中，其和亞鐵血紅素相互結合，形成硫醇-亞鐵-一氧化碳復合物，該復合物在450nm處具有最大特征吸收波譜[1]。P450不但在有害異物的脫毒，類固醇的生物合成以及人體的藥物代謝中起非常重要的作用[2-3]，而且在天然產物的生物合成中也起到非常關鍵的作用[4-5]。

放線菌，尤其是其中的鏈霉菌屬，作為抗生素的主要來源之一，已經被人們研究了幾十年。近年來，該菌屬的P450酶取得了進一步的研究進展，主要表現在以下幾個方面：一是隨著基因組測序技術的普及化和廉價化，人們可以從基因組水平發現P450酶，對P450酶序列的發現呈爆發式增長，逐漸向大數據發展；二是合成生物學的快速發展，人們對鏈菌屬來源的抗生素或者活性分子的生物基因簇的合成機制更加關注，對在基因簇中功能未知的P450酶做了深入地酶學特性鑒定；三是在結構生物學研究方面，相較于真菌或高等生物來源的P450酶，這些細菌來源的P450酶往往不是膜蛋白，這些樣本更容易得到晶體結構，更多鏈霉菌的P450酶的蛋白質結構得到解析，這對P450酶的催化機制和結構基礎的研究更加有利；四是鏈霉菌的P450酶不僅操作簡單而且催化多樣，適合作為研究酶催化改造的素材，化學研究人員陸續成功地開發出多種新的催化反應[6-8]。在本文中，對這些方面的最新進展都進行了綜述。

另外，更多化學研究人員參與到對P450的研究中成為近年來的一個趨勢。在化學合成中，碳氫活化反應是將氧原子插入到不活潑的碳氫鍵上，是反應最困難和研究最熱門的反應之一，這類反應也可以由P450催化完成[9-11]。這使得P450酶成為目前在合成生物學、結構生物學、酶工程以及有機化學中，研究最為廣泛的酶之一。

1 鏈霉菌P450的特點

1.1 P450催化反應的類型多

P450催化的反應類型之多[12-14]，是非常少見的。目前，在鏈霉菌屬，功能已經有試驗證實的P450酶大約有不到200個左右[15]。按大類主要分為氧化、脫氫、偶合以及各種成鍵反應。其反應具體涉及十幾個反應類型，具體包括為羥化、環氧化、芳香環羥化、脫氫、硝化、芳香環的偶合、脫?；?、碳碳鍵形成、碳氮鍵形成、碳氧鍵形成以及碳硫鍵形成反應。

在氧化反應中，最基本的反應是羥化反應。在天然產物的合成中，大部分的P450酶是起到羥化的功能，大約占到所有功能的三分之二。P450也能催化環氧化反應和芳香環的羥化反應。環氧化反應經?？梢栽诰弁肿拥暮铣芍锌吹?，因為這樣的分子往往具有很多碳碳雙鍵，可以發生環氧化來保持構型。例如PimD(CYP161A2)催化聚烯抗生素納他霉素(pimaricin)的碳4位和碳5位產生環氧化[16]。OleP(CYP010D1)是一個在竹桃霉素(oleandomycin)合成中負責環氧化的P450酶，它環氧化碳8位和8a位上的兩個碳原子[17]。阿嗪霉素B(azinomycin B)的生物合成途徑中的AziB1是催化芳香環的羥化反應的P450酶，它負責芳香環萘甲酸上的羥化反應[18]。這類羥化反應的機制，被認為是首先發生在芳香環上的環氧化反應，環氧化開環，借助氫氫轉移完成芳香環的重構。

脫氫反應中，P450酶可以完成2個或更多電子的脫氫反應，將一個sp3雜化的碳原子變為一個sp2或者sp1雜化的碳原子。對于脫氫反應的分類不是十分清楚，因為在經過2～3次脫氫后往往伴隨著非酶反應的脫水，最終，形成酮、醛和酸。XiaM是一個在吲哚倍半萜廈霉素A(xiamycin A)生物合成途徑中，將甲基轉化為羧酸，還產生醇醛等中間體的P450酶[19]。另一個例子是在新型血管生成抑制劑Borrelidin途徑中的BorJ，它可以在一個四電子氧化的過程，將一個甲基轉化為一個醛[20]。另一類脫氫反應是由P450的去飽和酶完成的。當底物變為自由基形式，就會在拔取氫原子和羥化之間產生一個競爭，羥化的產物和去飽和的產物之間是不能互相轉化的。一般是羥化的產物為主產物，但有時也有去飽和的產物是主要的產物的情況。在lactimidomycin(LTM)的生物合成中，LtmK可以將95%以上的LTM轉化為8,9-dihydro-LTM。同時，產生小于5%的8S和9R的羥化產物[21]。GdmP(CYP105U1)是一個在格爾德霉素(geldanamycin)生物合成中的去飽和酶，允許自由基重綁定到底物上，在其發酵菌的發酵液中分離到兩種立體構型的羥化產物[22-23]。這些結果表明去飽和反應是可以由酶反應來控制的。

偶合反應中，芳香環的偶合反應常常對天然產物起到多種不同的作用，能夠創造出結構的多樣性，如黑莫他丁(himastatin)和julichromes[24-25]；能夠使柔性的骨架更加地剛性，如糖肽抗生素(glycopeptide antibiotics, GPA)和星形孢菌素(staurosporine)[26-27]；還能夠聚合單體產生防曬的天然產物，如黑色素(melanins)[28]。天藍色鏈霉菌的CYP158A1和CYP158A2分別可以聚合淡黃霉素(flaviolins)形成可以抵抗紫外線輻射的多聚體。盡管這兩個蛋白有60%的序列同源性和相同的底物結合模式，但CYP158A1只形成二聚體的flaviolins，而CYP158A2至少形成4種flaviolins的聚合體[29-30]。相似的，灰色鏈霉菌的P450酶(CYP107F1)順序地催化氧化1,3,6,8-tetrahydroxynaphthalene(THN)[31]，首先完成分子間的酰基偶合反應，再通過一個分子內的?；己戏磻詈螅纬珊谏亍Ｄ壳?，對于許多雙?；己戏磻€不是很清楚這些酶是利用自由基機制，還是利用正離子機制。

成鍵反應中，StaP(CYP245A1)是一個負責分子內碳碳鍵形成的P450酶，它是在星形孢菌素的生物合成途徑中，在兩個chromopyrrolic acid的吲哚環之間形成碳碳鍵，經過一系列的質子化和異構化反應產生吲哚并咔唑(indolocarbazole)的六元環[32]。TxtE是一個來源于植物病原菌鏈霉菌的P450酶，參與植物毒素thaxtomins的生物合成，產生碳氮鍵的硝化發生在色氨酸的碳4位[33-34]。HmtT負責催化黑莫他丁中六氫吡咯環的碳氮鍵形成，氮原子進攻碳2位，形成碳氮鍵，碳3位上的羥基離去。相似的，StaN(CYP244A1)借助糖上碳5位的羥化，形成糖苷鍵，接著質子化脫水產生親電的氧鎓正離子[35-36]。SgvP是一個在灰綠霉素(griseoviridin)的生物合成中，形成一個包含硫醇烯基團的9元環。據推測，這個反應是通過環氧化不飽和的胺基，引起硫原子親核進攻α碳原子催化碳硫鍵的形成[37-38]。

1.2 P450催化反應的選擇性好

由于羥基的引入，P450的催化往往具有構型和構象的立體選擇性。在天然產物合成的過程中，這些反應可以讓產物構型更穩定，同時，在天然產物的多樣性中發揮非常重要的作用。在糖肽抗生素中最大的特點，是它的七肽骨架形成多個雙芳香橋(C-C)或者雙酰脂橋(C-O-C)，如著名的萬古霉素。這些結構是由P450酶催化完成的，而且，這個結構的存在與否與這類化合物的活性密切相關的。如果線性的或者不完整的萬古霉素中間體，就會失去了原有的良好的抗菌活性。在鏈霉菌中，GPAA47934具有4個這樣的芳香橋，而萬古霉素只有3個這樣的芳香橋。4個CYP165家族的P450酶，StaH、StaG、StaF和StaJ分別負責C-O-D環，F-O-G環，D-O-E環和A-B環合成[31,39]。這些酶都具有自身獨特地催化位點，并形成具有立體選擇性的結構。

1.3 P450催化反應的功能多

P450在催化過程中，往往一個酶具有多步催化功能。最為著名的是PikC(CYP107L1)，它可以催化完成在不同大環內脂環上的7個不同位置的羥化反應，它可以催化12元環內脂產生抗生素酒霉素(methymycin)和新酒霉素(neomethymycin)，在不同位置完成兩次羥化反應產生抗生素novamethymycin[40-41]，也可以催化13元環抗生素那波霉素(narbomycin)產生苦霉素(pikromycin)[42-43]。來源于鏈霉菌Streptomyces thioluteus的P450酶AurH，在金鏈菌素(aureothin)的生物合成中，催化合成具有立體選擇性的四氫呋喃環。兩個碳氧鍵按順序地形成：首先是碳7位的亞甲基產生一個羥化的中間體，然后，是新產生的羥基和碳9a位[44-45]。目前，還不知道是否這種雜環化是利用一個雙羥基中間體還是自由基中間體來完成，相似的機制也出現在阿維菌素的合成過程中。

1.4 P450在基因組水平大量存在

不同于一般細菌中，P450數量較少或者甚至沒有，例如大腸埃希菌和鼠傷寒沙門菌都沒有P450酶基因的存在[46-47]，在鏈霉菌中，存在相對多的P450酶基因。例如兩個工業化生產菌種，阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)和天藍色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)，分別產生阿維菌素和放線紫紅素，已經完成了全基因組的測序[48-49]。在這兩個菌種中，都發現了大量的P450酶基因，分別是18個和33個，占到全部編碼基因的0.2%和0.4%[50-51]。這個數字大大高于其他細菌中的P450數量。目前，在鏈霉菌中，大概有180個功能已知P450酶，無論是通過體外試驗、基因敲除，還是異源表達和結構學研究，但還有大量未知功能的P450酶有待于去進一步功能解析。

2 鏈霉菌P450的最新進展

2.1 P450在合成生物學上的進展

2015年，中科院南海海洋所的張長生課題組完成了heronamide生物合成途徑中的后修飾的P450酶HerO的發現，該酶催化碳8位的羥化反應[52]。抗生素oleandomycin生物合成途徑中的負責環氧化的P450酶OleP也完成了功能和結構的鑒定工作，該酶是目前唯一一個在未激活碳碳鍵上完成環氧化的P450酶[53]。利用比較全基因組學，挖掘thiolactomycin的生物合成基因簇時，發現了一個不常見的P450酶，該酶負責thiotetronate ring的形成[54]。在研究pentalenolactone的時候，在最后一步修飾時，發現一個催化氧化重排的P450酶[55]。在platensimycin的生物合成途徑中，發現了形成脂環的P450酶[56]。另外，對pimaricin基因簇中的P450酶的刪除，可以產生一些新的結構類似物，這些類似物表現出更好的的抗真菌活性[57]。同樣的情況，也出現在natamycin的生物合成中[58]。

2.2 P450在結構生物學上的進展

最早的P450酶的晶體結構是于1985年被解析，是一個來自于惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)的P450酶(CYP101A1)[59]。隨后，每年P450的結構都會有較大幅度的增長。到目前為止，蛋白質數據庫(protein data bank, PDB)中，來自于鏈霉菌的有29個，13個是來自于聚酮的，8個是來自于非核糖體肽的，3個是來自于聚酮-非核糖體肽雜合體的，4個是來自于萜的生物合成途徑。另外，還有一個是未知功能。

2017年，參與griseoviridin生物合成的P450酶SgvP，作為第一個形成碳硫鍵的P450酶，得到了2.6埃的晶體結構，結構顯示Pro237在碳硫鍵的合成中起到關鍵作用[60]。糖肽抗生素合成中，NRPS(nonribosomal peptide synthetase)中的X-domain和P450的復合物結構也得到了解析，為NRPS與外源蛋白相關作用的研究提供了結構基礎[61]。糖肽teicoplanin中負責環化D-O-E環的OxyA的晶體結構也得到了解析[62]。另外，一些來源于鏈霉菌中新的P450酶結構也到的了解析，如參與消炎藥物diclofenac和阿維菌素合成的CYP105D7和CYP107L2[63-64]。

2.3 P450在分子改造上的進展

PikC是一個對十元環和十二元環大環內脂都能進行兩位點羥化的P450酶。這是一個系統研究的酶，從野生型、共結晶以及突變型的蛋白質結構，到計算機模擬，產業化應用平臺的構建，將非專一性改造為可以進行精準羥基化的酶。首先，是它的晶體結構和不同底物YC-17和那波霉素的共結晶結構(PDB ID: 2C6H,2C7X)獲得了解析[65]，結果表明紅霉脫氧糖胺以兩種不同的方式和酶結合，一種是深埋的，一種是暴露的。消除Asp50的負電荷可以明顯地增加酶的活性，在突變體Asp50Asn的晶體結構中，底物和酶都是以深埋的方式結合的，這樣，它的兩步底物結合機制被推測。利用底物工程化的技術，可以將碳10位和碳12位的產物從原來1:4變為20:1[66]。另外，通過分子動態模擬和底物工程化策略，在共結晶結構的基礎上，結合計算機計算，對P450酶PikC進行蛋白質工程，得到了可以催化不活潑碳氫鍵的新活力，現在該酶已經構建成為工業應用的一個平臺[67]。

AurH是一個存在于聚酮抗生素金鏈菌素生物合成途徑中的多功能P450酶，分子改造是使其接受新的底物，產生新的產物。AurH隨機的氧化碳7位和碳9a位導致四氫呋喃的形成。它的晶體結構(PDB ID:3P3L, 3P3O, 3P3X, 3P2Z)是第一個CYP151A亞家族的P450酶結構。蛋白配體對接模式顯示底物的吡喃酮環占據了一個疏水的活性口袋，通過改變活性口袋大小，來實現新反應。突變體Phe89Trp和Thr239Phe明顯地減小了酶的催化效果，并且產生了一種新的金鏈菌素的類似物[68]。大的氨基酸色氨酸和苯丙氨酸借助位阻效應改變了底物吡喃酮的綁定模式。這些突變體催化立體選擇六電子的轉化，借助羥基和醛基的中間體，將沒有活性的碳9a位上的甲基變為羧酸。同時，在相關突變體菌種的發酵液中，分離到新型的結構類似物。

在分子改造方面，美國加州大學的Arnold課題組做出了非常的突出的貢獻。TxtE是第一個報道的有效催化硝化底物色氨酸的酶，分子改造是改變其底物結合位點，將硝化反應的位點從色氨酸的碳5位變為色氨酸的碳4位。它的單獨晶體結構和含有色氨酸底物復合物的晶體結構已經得到解析，但是由于天然狀態下該酶F-G環的不穩定，導致并沒有搞清楚該環是如何和底物色氨酸如何相互作用的。借助計算機分子動態模擬軟件，使用馬爾科夫狀態，對F-G環的開環、閉環和過渡態3種狀態進行了重構。處于F-G環上的His176對于酶的不同狀態起到關鍵的控制作用[69]。計算結果顯示增加了176位的空間位阻，導致底物結合位點的偏移。

3 結語

P450酶作為自然界中存在最廣泛和催化最多樣的酶，在鏈霉菌屬廣泛存在，對它們的研究還只是一小部分，有待于進一步研究。P450酶作為一個金屬蛋白，在催化過程中，可以說借助蛋白為載體，實現了金屬催化。而更多化學背景的研究人員開始利用P450酶完成一些新的催化反應，將酶催化和過渡金屬催化相結合，讓生物學和化學充分融合，相信這個方向還會有更多有意思的研究出現。同時，借助計算機的動態模擬和共結晶的晶體學手段，相信對于P450酶的研究可以更上一個臺階，從分子水平對P450酶的催化機制做進一步解析，為后續的蛋白質改造奠定理論基礎。結合定向改造的方法，讓這些酶發揮出更大的作用，完成更多特異性的反應。另外，基因組研究的快速發展加速了酶的研究，人們不再單純的依賴表型或現象去發現酶，全基因組測序技術可以讓你馬上發現所有備選的酶，為快速研究酶提供了新的可能。目前，本課題組以圍繞部分鏈霉菌的P450展開結構生物學研究，相關工作會在后續報道。