多黏菌素E耐藥基因mcr-1在我國養殖場的流行及其傳播擴散

王政 付玉林 汪洋 江海洋

(中國農業大學動物醫學院，北京 100193)

多黏菌素類抗生素是多黏桿菌培養液中提得的一組多肽類抗生素，有5種成分(A、B、C、D和E)。多黏菌素B和E被批準用于人醫臨床，多黏菌素E被批準用于動物[1]。多黏菌素E又稱黏菌素，在養殖場中通常以硫酸黏菌素預混劑的形式作為飼料添加劑來使用，用來促進動物生長或治療由腸桿菌科細菌引起的疾病。

多黏菌素E因其嚴重的腎臟毒性和神經毒性曾在臨床上被禁止使用，但隨著革蘭陰性菌對氨基糖苷類抗生素的耐藥性越來越嚴重，20世紀90年代，多黏菌素E又重新被應用于臨床，并被認為是臨床上治療多重耐藥陰性菌感染的最后一道防線，世界衛生組織也已將其歸為最關鍵的抗生素之一[1-2]。在我國，多黏菌素E于20世紀80年代初批準用于動物，但目前還未批準用于人醫臨床。細菌對多黏菌素E產生耐藥性的主要機制，是細菌染色體編碼的二元調控系統pmrAB和phoPQ以及相關的調控基因mgrB的突變導致脂質A的修飾發生改變，脂質A與多黏菌素E之間的靜電作用力下降，從而使多黏菌素失去抗菌活性[3]。由于突變耐藥菌只能垂直傳播，所以在較長的一段時間內，臨床調查顯示細菌對多黏菌素E的耐藥率都維持在一個較低的水平。但近年來，來源于動物養殖場的分離菌株對多黏菌素E的耐藥率出現了明顯上升，針對這一現象，Liu等[4]研究發現，一種編碼磷酸乙醇胺轉移酶的基因mcr-1，可介導細菌對多黏菌素E耐藥。與突變耐藥菌不同，該基因還可以發生水平傳播。流行病學調查顯示，攜帶mcr-1的細菌在動物養殖場已經廣泛流行，分離率達21%，這表明mcr-1的流行是養殖場分離菌株對多黏菌素E的耐藥率出現上升的主要原因[4]。雖然目前陸續有mcr-2、mcr-3、mcr-4、mcr-5等新的mcr變體被發現[5]，但是，在我國介導細菌對多黏菌素E耐藥的基因仍然以mcr-1為主。

目前，mcr-1已在6大洲，30多個國家被發現，這表明mcr-1已在全球范圍內形成了流行[6-7]。在我國，已有25個省/自治區分離到了攜帶有mcr-1的細菌。其中，在動物源細菌檢測到mcr-1的省份或直轄市有黑龍江、新疆、寧夏、河北、湖北和重慶；在人源細菌中檢測到mcr-1的省份有海南、廣西、云南、江西、山西和甘肅；在動物源和人源都檢測到了mcr-1基因的省份或直轄市有遼寧、山東、河南、安徽、江蘇、浙江、福建、廣東、臺灣、四川、北京、上海和天津[8-13]。一份關于我國MCR-1陽性細菌的回溯性研究表明，在養禽場內MCR-1陽性細菌的分離率自2009年以來呈現出了逐漸上升的趨勢[14]，與此同時，在動物源性食品和醫院感染病人樣品中也都分離到了攜帶有mcr-1的細菌[4]。mcr-1能否從養殖場內傳播到養殖場外而威脅到公共衛生安全是研究者最關心的問題之一。為了評估mcr-1對人類公共安全的風險，在養殖場開展多黏菌素E耐藥菌的流行病學調查顯得至關重要，然而現在還沒有針對我國養殖場中mcr-1流行規律的綜合報道。本篇綜述對我國養殖場內mcr-1的流行規律進行了總結，對養殖場內MCR-1陽性細菌由場內傳播到場外的傳播途徑進行了歸納分析，以期找到mcr-1傳播擴散的特點，為相關研究人員提供參考。

1 mcr-1在養殖場的流行特點

已有的報道顯示，mcr-1在豬場、雞場、奶牛場、淡水魚養殖場中都有分布，其中豬場和雞場中MCR-1陽性細菌的分離率較高[15-17]。目前分離得到的MCR-1陽性菌株都屬于腸桿菌科細菌，包括大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、沙門菌、志賀氏菌、陰溝腸桿菌、產氣腸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、抗壞血酸克呂沃爾菌等[18-20]。其中，mcr-1陽性大腸埃希菌的分離率最高[21]。本文將以mcr-1陽性大腸埃希菌為代表，從分子分型，質粒分型，基因側翼環境3個層面來介紹mcr-1基因在腸桿菌科細菌中的流行特點。

1.1 mcr-1陽性大腸埃希菌的分子分型

目前使用最多的分子分型方法是多序列位點分型(multilocus sequence typing, MLST)，從MLST分型結果來看，mcr-1陽性大腸埃希菌的ST分型多樣，沒有主要的流行型。如Wang等[6]的研究顯示，人醫臨床上MCR-1陽性細菌的ST型有ST602、ST101、ST410、ST95、ST1193、ST354、ST156、ST10、ST117、ST405、ST131和ST648等；Yang等[10]的研究顯示，雞源mcr-1陽性大腸埃希菌的ST型有ST48、ST10、ST616、ST88、ST744、ST117、ST3044、ST2491、ST2345、ST1642、ST5909和ST501等；豬源mcr-1陽性大腸埃希菌的ST型有ST1114、ST167、ST48、ST410、ST156和ST165等[22]。Zhou等[23]在浙江地區的河流中也檢測到了16株MCR-1陽性細菌，ST型分別為ST10、ST101、ST206、ST181、ST1638和ST43。盡管上述研究者報道的多種ST型菌株來源不同，但經分析發現有一些ST型如ST10、ST156和ST648等在人和動物中都有分布，而ST10在人、動物和水環境中都有報道[6]。還有研究顯示ST156和ST648大腸埃希菌與多重耐藥菌有關，這兩種ST型可同時含有mcr-1和blaNDM-5[24]。此外，ST648是人醫臨床上的流行性菌株，mcr-1/ST648的流行傳播會給臨床用藥帶來很大的挑戰[24]。

不同環境、不同來源的菌株中都分離到了MCR-1陽性菌株，且擁有多樣的ST分型，一方面說明mcr-1的傳播是依靠水平傳播元件介導的，另一方面也表明陽性菌株擁有很好的適應性。在其他種屬如沙門菌中，攜帶有mcr-1的菌株ST型也多種多樣[25]，但也有報道顯示，ST34是鼠傷寒沙門菌的主要流行型[8,26]。

1.2 攜帶mcr-1的質粒分型多樣

根據質粒不相容性原理可以將質粒分為不同的Inc型，同一Inc型的兩種質粒不能共存于同一個細菌中。文獻報道mcr-1基因多位于質粒上，其Inc分型有IncI2、 IncX4、IncHI1、IncHI2、IncF、IncFI、IncFII和IncP[27]。其中，IncI2和 IncX4在mcr-1陽性質粒中最為常見。IncI2型質粒是窄宿主質粒，通常只存在于腸桿菌科細菌中，該型質粒多可以發生接合轉移。此外，該型質粒也與產超廣譜β-內酰胺酶基因如blaCTX-M-55傳播有關[28]。IncX4是大腸埃希菌中分布最廣的質粒之一，也是窄宿主質粒，只能在腸桿菌科細菌中流行。該型質粒是自轉移質粒，自身含有Ⅳ型分泌系統，松弛酶基因和結合蛋白基因，能夠以較高的接合轉移頻率在同種細菌間發生接合轉移[27]。尤其值得引起重視的是在一種廣宿主質粒IncP中也發現了mcr-1[29]，這提示目前雖在腸桿菌科以外的細菌種屬中尚未檢測到mcr-1基因，但存在mcr-1傳播到其他種屬細菌中的可能。

1.3 mcr-1的傳播流行與插入序列ISApl1密切相關

mcr-1的水平傳播一方面與質粒相關，另一方面也與mcr-1的側翼環境如插入序列相關。目前NCBI(national center for biotechnology information)上公布的含有mcr-1的序列結構顯示mcr-1的側翼中有一段保守的序列結構ISApl1-mcr-1-pap2。Tn6330(ISApl1-mcr-1-ISApl1)的發現證實mcr-1可以隨著轉座子的移動而發生水平轉移[30]。Wang等[31]已報道目前mcr-1的側翼序列至少可以分為8類。這表明mcr-1在質粒中正在經歷一個適應的過程，如Sun等[27]的報道中提到了mcr-1在IncX4型質粒中有一個進化的過程。

總的來說，MCR-1陽性細菌已在我國養殖場(特別是養禽場和養豬場)中廣泛流行，其傳播方式以水平傳播為主。質粒是介導mcr-1水平傳播的主要元件，其可以在相同種屬甚至不同種屬的細菌間發生接合轉移。此外，轉座子Tn6330在mcr-1的傳播中也起到了重要作用。通過以上傳播機制，在藥物的選擇壓力下，攜帶有mcr-1的細菌得以在動物源腸桿菌科細菌廣泛傳播。

2 mcr-1的傳播擴散

根據現有的研究結果可以推測養殖場可能是mcr-1傳播擴散的源頭，一是因為養殖場MCR-1陽性菌株的分離率較高，而醫院感染病人中的分離率相對較低[4]。二是因為養殖場和人類生活密切相關，如食源性細菌如空腸彎曲桿菌、艱難梭菌等可以通過食物鏈途徑感染人類[32-33]。MCR-1陽性菌株基本都為腸桿菌科細菌，細菌一方面可以通過污染動物源性食品來進行傳播擴散；另一方面，動物的排泄物通過堆肥處理后返田，也可能會污染農作物，如蔬菜，小麥等，進而威脅到公共安全[34]。

2.1 直接接觸或食物鏈途徑污染

mcr-1的傳播擴散與食物鏈有關[35]，如Liu等[4]的報道中提到，從雞肉等熟食中也分離得到了攜帶有mcr-1基因的菌株，Liu等[36]調查了深圳市超市或市場上銷售的豬肉、雞肉、蝦等食品，共分離得到了109株mcr-1陽性腸桿菌細菌。這表明mcr-1基因有沿食物鏈傳播的風險。養殖場內，mcr-1通過直接接觸傳播也有文獻報道，如在老撾的一次流行病學調查中發現，養豬場一名飼養員糞便中分離的MCR-1陽性細菌，與豬糞便中分離的具有相同的脈沖場凝膠電泳(PFGE)譜型，提示該菌在動物和人之間發生了克隆傳播[37-38]。

2.2 其他傳播媒介

除食物鏈途徑外，環境介導的傳播，如水環境，土壤等[23,39]，也漸漸引起了人們的關注。其中養殖場污染物對周圍環境的影響是人們研究的熱點之一。現代化養殖場普遍采樣高密度的動物養殖模式，而養殖場囤積的糞便污染物的處理一直是一個難題。動物的糞便一方面殘留有抗菌藥物或其活性代謝產物，同時也含有豐富的耐藥菌或耐藥基因。在動物糞便中就殘留有多黏菌素E的活性代謝產物[40-41]。在我國，很多養殖場會通過堆肥的方式處理糞便，然后施用到農田中。堆肥雖然是有機肥料，但堆肥的使用也伴隨著耐藥基因或耐藥菌隨堆肥進入到了環境中，進而影響到人類[42-43]。我國是養豬大省，據統計，每年豬場大概會產生6億噸堆肥，這不容忽視[44]。已有文獻報道在豬場環境(土壤、堆肥等)中就分離得到了攜帶有mcr-1的細菌[45-46]。

除了堆肥等環境媒介可以促進耐藥菌發生水平傳播以外，一些重要的生物傳播媒介如蒼蠅等對耐藥菌的傳播也可能起到促進作用。Wang等[47]的研究表明，blaNDM在肉雞生產鏈條中的傳播擴散與蒼蠅密切相關。揚州大學Zhang等[48]的研究也表明蒼蠅在耐藥基因傳播過程當中起到的中介作用。

綜上所述，養殖場內的MCR-1陽性細菌可能通過食物鏈或環境介質等由養殖場向養殖場外傳播擴散，雖然目前還沒有直接的證據證明mcr-1可以通過這些途徑感染人群，但潛在風險不容忽視，Wang等[6]的研究就顯示MCR-1陽性菌株的定植與病人生活地距離養殖場的遠近有關系。

3 結論與展望

本文綜述了mcr-1在我國養殖場的流行傳播特點，簡要闡明了其傳播流行的機制，同時歸納了MCR-1陽性菌株由養殖場向養殖場外傳播擴散的可能途徑。由于攜帶mcr-1的質粒的多樣性和良好的適應性，mcr-1在腸桿菌科細菌中形成了廣泛流行，存在著由養殖場傳播到養殖場外的風險。人們生活在同一個地球上，對抗耐藥菌需要全世界的共同努力。目前，已有國家和地區采取了相應的措施來限制多黏菌素耐藥菌的擴散傳播，如我國農業部已在第2428號公告中明確提出，2017年4月30號前，硫酸黏菌素預混劑在養殖場將被禁止作為飼料添加劑來使用，在英國和歐盟也有類似的措施實施[1]。

限制多黏菌素E在養殖場的使用的只是防控細菌耐藥性的第一步，還有很多問題需要人們去解決。對科研工作者來說，評估多黏菌素E的使用對MCR-1陽性菌株在養殖場傳播擴散的影響以及對人類公共安全的威脅需要盡快完成；同時，在動物和人醫臨床上的耐藥性監控需要繼續加強，爭取能形成定期的流行病學調查和監控；此外，探索有效經濟的污染物處理方法也十分重要。就養殖場來說，應該規范養殖場的用藥制度，明確獸醫在養殖場的責任和義務。只有共同努力，我們才能更好的應對超級細菌帶來的風險。