葛根素治療骨質疏松癥相關分子機制研究進展

丁聚賢謝興文許偉李寧李鼎鵬黃晉潘鑫戊宋敏蘇積亮宋學文

1. 甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000 2. 甘肅省中醫藥研究院，甘肅 蘭州 730050 3. 甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050

骨質疏松癥(osteoporsis，OP)是以全身性骨量減少、骨脆性增加、易發生骨折為特征的全身代謝性骨病[1]。我國骨質疏松的總患病率為6.6%～19.3%，平均為13%，其中約20%的患者會發生骨質疏松性骨折[2]。OP患者因其自身骨基質含量減少，骨密度(bone mineral density，BMD)降低，骨強度下降，骨皮質變薄，骨小梁減少，受到輕微暴力即可發生骨折。有研究表明[3-5]，I型膠原纖維A1基因結構區的突變、維生素D受體基因多態性的表達、雌激素受體基因型的表達、低密度脂蛋白受體相關蛋白5基因的突變、骨保護素(osteoprotegerin，OPG)遺傳多態性及血清神經生長因子水平的下降均會導致骨強度降低而增加脆性骨折的風險，其嚴重影響著OP患者的生活質量。因此對于OP患者來說，在骨折發生前的防治尤為重要。近年來，葛根的主要有效成分葛根素憑借其具有的類雌激素效應在骨質疏松癥的治療中取得了較好的療效，越來越多的作用靶點及分子機制被闡明。本文將從影響OP的相關分子通路與葛根治療OP的相關分子機制方面進行綜述，旨在為臨床運用葛根治療OP提供方法和思路。

1 調控骨質疏松癥發生發展的常見通路及相關分子機制

1.1 調節成骨細胞增殖及分化的相關分子機制

生理狀態下，在骨的生長周期中，參與骨形成的成骨細胞(osteoblast，OB)與骨吸收的破骨細胞(osteoclast，OC)始終處于動態平衡、不斷重建的過程。當破骨作用大于成骨作用時會導致OP的發生。任何影響骨細胞代謝的機制均會導致骨代謝紊亂，從而導致OP的發生，此類機制也成為了防治骨質疏松的入手點。較早進行研究的Ca、P元素代謝主要是通過促進OB增殖及分化，抑制OC的生成及活性來調節骨代謝[6]。近年來，許多影響骨細胞代謝的信號通路及小分子機制不斷被闡明，且某些機制互相作用并影響。RANKL/RANK/OPG對維持OB和OC的平衡有著重大意義，與OP的發生、發展有著密切的關系[7]。Ca2+信號轉導途徑參與調控RANKL誘導的OC的活化及分化過程，也參與調控OPG對OC分化與活化的抑制[8]。

核因子KB(NF-kB)在骨重塑上具有重要的作用，參與著細胞的生長、分化等基因表達調控[9]。有研究認為[10-11]，生長轉化因子-β(TGF-β)在骨重建中能夠促進成骨分化，增強骨密度，抑制OC的活性，促進OB成熟。其中TGF-β1是骨代謝重要的偶聯因子。骨形成蛋白-2(BMP-2)具有誘導OB分化作用，是調節骨代謝的重要因子[10]。堿性磷酸酶(ALP)則是細胞早期礦化階段的主要標志[12]。Smad2、Smad3[13]作為TGF-β1信號轉導通路中的信號分子，其活性間接影響著骨的形成、重塑及礦化過程。Runx2[14]有促成骨效應，可誘導BMSCs發育為OB，缺失將導致骨發育不良。同時研究發現[15]，miR-204負調節Runx2而抑制成骨細胞基因的表達。Wnt/β-catenin信號通路與骨骼發育、成熟、重建有重要作用，其主要通過調控OB定向分化及特異基因的表達，增強OB活性，促進細胞外基質的礦化過程[16]。有研究顯示[17]，Wnt/β-catenin信號通路可通過RANK/RANKL/OPG 信號通路抑制骨吸收，可能與β-catenin能夠上調成骨細胞表達OPG有關。促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族信號轉導途徑參與細胞生長、分化、凋亡等多種生理過程，能通過傳導胞外信號至胞內及其核內，激活轉錄因子，調節基因表達[18]，可能與其增加鈣沉積、誘導ALP的表達有關。近年研究發現[19]，其家族成員ERK1/2在OB的增殖分化中發揮重要作用。PTH信號轉導通路既可促OB生成又抑制其凋亡，從而促進骨形成代謝[20]，其主要機制是與受體(PTHR)結合后通過解離破骨復合物[21]并會激活Wnt信號通路來促進骨的合成代謝。

1.2 調節破骨細胞凋亡的相關分子機制

介導OC生成的細胞因子有RANKL、TNFα、IL-6、TGFβ、IGF I、IGF II等[22]。TNFα相關因子RANKL可誘導單核細胞分化為成熟OC，TNFα可通過MEK/ERK信號通路來抑制OC的調亡[23]。TGFβ可通過調節抗酒石酸酸性磷酸酶活性抑制OC的骨吸收功能[24]。IL-6 能提高OC活性并參與介導機體雌激素水平的下調，IGF I、IGF II在所有腫瘤標本的基質細胞中均有很強的表達[25]。若缺失此類細胞因子，可出現破骨細胞合成障礙。OPG[26]是一種由OB分泌的糖蛋白，既能促進成骨細胞的分化，也可抑制破骨細胞的分化與合成，是抑制破骨細胞分化的關鍵因子，其基因多態性與骨強度有著密切關系。孫自強[27]研究發現AKT/mTOR/ULK1信號通路介導APG調控OC自噬并增強自噬水平。ULK1可促進自噬小體的形成，AKT參與著多種細胞增殖、分化的調節，mTOR參與OC的生成。研究發現[28]，抑制AKT的磷酸化或mTOR活性均會抑制OC的分化和骨吸收。PPAR家族成員PPAR-γ通過直接調控骨細胞的分化而抑制OB活性，促進破骨細胞形成，可能與Wnt 信號通路抑制有關[29]。PI3K/AKT/FoXO信號轉導通路主要通過對下游多種增殖和凋亡相關靶基因(Bmi、Bax、CytC、AIF、Caspase-3為參與增值與凋亡的關鍵基因)的調控以及對Wnt/β-catenin通路的抑制來介導細胞代謝過程[30-31]。其通道最終通過影響FoxOh系列分子的活性而抑制相關下游靶基因[32]，進而介導成骨細胞增殖，破骨細胞凋亡過程。

2 葛根治療OP的相關分子機制

2.1 葛根素促進成骨分化的分子機制研究

葛根主要功能成分包括異黃酮類化合物、葛根甙類化合物、三萜皂甙等，其中異黃酮類化合物是葛根的主要有效活性成分[33]。葛根素又稱為葛根黃酮，是葛根提取物中粗異黃酮中的主要單體成分，分子式：C21H20O9，是天然的植物性雌激素。

錢康琦等[34]利用Western Bloting方法檢測葛根素提取液對OB 的TGF-β1、Smad2、Smad3基因表達，發現葛根素可以抑制TGF-β1蛋白與Smad2/3蛋白的表達，表明臨床運用的葛根素可以通過抑制TGF-P1與Smad2/3基因表達來抗OP。張瑩瑩[35]的研究發現過表達miRNA-204可下調Runx2的蛋白表達，葛根素可通過下調miRNA-204來上調成骨細胞Runx2的表達、促進成骨細胞的增殖和分化。曾祥偉[36]的研究顯示，葛根素可以可提高Runx2的表達，同時通過抑制TRPM3的表達來調節細胞內外的Ca2+濃度，促進OB的增殖、分化及礦化。路立花等[13]發現葛根素通過升高BMP-2的表達水平，活化ALP活性，從而促進生物礦化。李海[37]研究發現葛根素能使去卵巢大鼠血鈣、血磷和ALP基本恢復正常，可以起到促進礦化的作用。王曉暉等[38]研究發現在高糖情況下，成骨細胞的增殖、分化和Ⅰ型膠原mRNA表達處于抑制狀態，但加入葛根素后能提高成骨細胞的增殖、分化和Ⅰ型膠原表達，證明葛根素對糖尿病骨質疏松癥有治療作用。王昌等[39]研究了葛根素對氧化應激后OB的影響，發現葛根素對氧化損傷的OB具有抗氧化和清除氧自由基，增加OB增殖、分化和礦化功能的作用。呂海宏等[40]用葛根素培養液培養OB，檢測ERα mRNA表達及細胞增值率，發現葛根素能促進成骨細胞增殖，提髙ALP活性，可能與抑制雌激素受體α(ERα)啟動子甲基化、增加ERα mRNA的表達有關。胡洪生等[30]的體外實驗研究發現，葛根素能夠增強OB內PI3K/AKT/FoXO信號通路的活性，抑制OB內凋亡基因的表達量，促進OB的增殖。康鑫等[41]研究發現葛根素能夠促進ERK1/2蛋白的磷酸化，促進成骨細胞增殖周期轉變，并且能提高細胞周期蛋白cyclin D1和CDK4 的表達。由此可見，葛根素在促進OB增殖、分化、成熟、骨礦化等方面有著多通絡、多靶點、以及多通絡協調作用。

2.2 葛根素抑制破骨活性的分子機制研究

袁斯遠等[42]應用葛根素對破骨前驅細胞RAW 264.7進行干預，觀察葛根素對體外培養破骨細胞形成以及成骨細胞OPG、RANKL mRNA表達的影響。發現葛根素能夠抑制RAW 264.7誘導破骨細胞的形成，且能夠通過作用于成骨細胞MC3T3-E1上調OPG mRNA和下調RANKL mRNA的表達間接調控破骨細胞。黃漫華等[43]通過觀察葛根素對破骨細胞自噬相關蛋白(LC3和p62蛋白)和AKT-mTOR信號通路相關蛋白(AKT、p-AKT)表達的影響，證明葛根素能有效促進破骨細胞內的自噬相關蛋白的表達。早期已證實p62是自噬活性的有效標記蛋白，但AKT-mTOR信號通路是否為其有效的通路，仍需后期實驗佐證。

2.3 葛根素調控脂代謝的分子機制研究

王珣[44]通過體外試驗研究絕經后大鼠脂肪來源干細胞(ADSCs)的成骨分化能力，采用含葛根素的培養液進行ADSCs的培養誘導，通過ALP檢測、茜素紅染色，發現葛根素具有體外促進 ADSCs 成骨分化的效能，且無毒劑量下其成骨分化效能與濃度呈正相關，12 μmol/mL 時為最大有效的無毒劑量。齊振熙等[45]研究發現中等劑量葛根素可能通過上調Wnt/β-catenin信號傳導通路的關鍵因子Wnt 10b mRNA及β-catenin蛋白的表達，或降低GSK3β mRNA的表達從而間接抑制激素誘導骨髓間充質干細胞向成脂分化，多應用于激素性股骨頭壞死的治療，但具體作用機制尚未闡明。也有研究顯示[9,46]，低劑量的葛根素可通過AKT途徑Ser473蛋白的磷酸化促進3T3-L1前體脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化。由此可見，不同劑量下的葛根素可以抑制激素誘導的骨髓間充質干細胞向成脂分化，也可以促進成熟脂肪細胞分化，這也提醒我們，從調節脂代謝來影響骨細胞代謝，可能會是葛根素治療OP的另一條機制。

3 結語

骨質疏松癥是我國乃至全世界老年人骨折、骨痛的首要原因。其發病因素多、進程緩慢、后期多并發承重骨的脆性骨折，以脊椎、股骨頸、股骨粗隆、肋骨骨折較為常見。目前臨床治療 OP的西藥主要有抑制骨吸收類(雌激素、雙膦酸鹽類、降鈣素等)和促進骨形成類(氟化鈉、他汀類、雄激素、PTH)以及含維生素D的衍生物三大類。葛根素為中藥葛根的三大成分異黃酮類化合物的單體提取物。影響OP的通路與分子機制較多，因此也成為了治療OP的有效著手點。上述大量實驗研究證明，葛根素在OB和OC的代謝中可以通過多種轉導通路、作用于多個靶點來調節骨合成代謝以對抗OP。同時，據上述研究也發現葛根素在脂代謝調節途徑中可間接抑制激素誘導骨髓間充質干細胞向成脂分化，并可促進ADSCs向成骨分化，提示調整脂代謝可能也會是葛根素治療OP的另一種作用途徑。葛根素治療OP 的研究目前主要以實驗為主，臨床試驗研究較少，因此缺乏大樣本、多中心的臨床對照研究，且有數據表明葛根素可以引起發熱、變態反應、藥疹、過敏性休克，甚至溶血、肝腎功能損害等毒副反應[47]，提示研究人員在今后的研究中要逐漸傾向于臨床應用及不良事件的排除，令葛根素成為治療OP安全、高效的中藥提取物。