衰老動物模型及其研究進展

盧延華，管博文，孟愛民

(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，國家衛(wèi)生健康委員會人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，北京市人類重大疾病實驗動物模型工程技術(shù)研究中心，北京 100021)

據(jù)年鑒顯示，2017年末中國老年人口(65歲及以上)占全國總?cè)丝诘?1.4%，已達1.58億[1]。老齡化不可避免地伴隨一系列社會醫(yī)療問題，衰老相關(guān)疾病也給人類帶來了沉重的疾病負擔，如何延緩衰老、延長壽命、減少老年性疾病、改善生活質(zhì)量一直是社會的研究熱點。衰老動物模型，系指表現(xiàn)出與人類相似衰老表型的動物模型，在衰老機制和抗衰老藥物的臨床前研究中發(fā)揮著重要作用，目前廣泛應(yīng)用的衰老模型包括嚙齒類、非人靈長類、小型魚類以及無脊椎動物模型。近年來，不僅常規(guī)動物出現(xiàn)了新的衰老模型，如遺傳多樣性小鼠、INK-ATTAC 轉(zhuǎn)基因小鼠等，也增加了新物種的應(yīng)用，如非洲青鳉魚、非洲綠皮猴等，同時研究者也選用壽命不同的模型如裸鼴鼠和大小鼠以及蝙蝠、大小鼠和人類等進行比較研究，這些模型和方法也為衰老研究提供了新的手段。由于衰老是十分復雜的生物學過程，要充分進行比較醫(yī)學研究才能更好地將研究成果轉(zhuǎn)化，為人類健康老年提供保障。本文從衰老動物模型特點和應(yīng)用等方面進行綜述。

1 衰老及衰老相關(guān)疾病

衰老是指機體生長發(fā)育達到成熟期以后，各組織、器官隨著年齡增長而發(fā)生退行性變化的過程。目前存在許多衰老學說，如個體水平的遺傳學說，器官水平的免疫學說，細胞水平的線粒體損傷學說，分子水平的自由基氧化應(yīng)激學說等。細胞總體水平的衰老一般被認為是機體衰老的基礎(chǔ)，細胞衰老是指增殖細胞脫離細胞周期呈永久性生長停滯的狀態(tài)，衰老細胞可抵抗凋亡并長期存活，分泌大量衰老相關(guān)分泌表型使微環(huán)境發(fā)生變化，影響正常細胞生理功能，參與疾病的發(fā)生發(fā)展。衰老不可避免地會導致一系列疾病的發(fā)生，由于各大系統(tǒng)功能減退引起的代謝綜合征，以及腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病等，同時在衰老過程中腦組織易受到損傷而發(fā)生神經(jīng)退行性疾病，均導致了健康壽命的減少和生命質(zhì)量的下降。

2 衰老模型制備方法

衰老模型是指能夠表現(xiàn)出與人類相似的衰老表型，并且其潛在的生化機制與人類具有保守性的動物模型，包括自發(fā)性、誘導性和轉(zhuǎn)基因模型[2]。自發(fā)性衰老模型包括自然衰老和快速老化模型，自然衰老模型最符合人類衰老特征，主要表現(xiàn)為抗應(yīng)激能力、免疫功能以及學習記憶功能的減退，省略了手術(shù)或給藥步驟，是研究衰老機制較為理想的模型，但飼養(yǎng)周期長、健康狀況差、死亡率高且個體差異較大等特點也限制了自然衰老模型的廣泛應(yīng)用；快速老化小鼠(senescence-accelerated mouse，SAM)表現(xiàn)為隨著年齡增長出現(xiàn)快速老化且不可逆轉(zhuǎn)的特征，SAMP包括9個亞系，病理表現(xiàn)各異，其中SAMP8是應(yīng)用最多的亞系，也是研究學習記憶功能障礙和阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的理想模型。誘導性衰老模型是應(yīng)用最廣泛的衰老模型制備方法，主要包括D-半乳糖致亞急性衰老模型、β淀粉樣蛋白誘導模型、去胸腺誘導模型、γ射線誘導模型、氯化鋁誘導和亞硝酸鈉等藥物誘導模型。轉(zhuǎn)基因衰老動物模型指通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)改變疾病相關(guān)基因表達，使實驗動物表現(xiàn)出相應(yīng)的衰老表型，隨著衰老機制的深入探索和轉(zhuǎn)基因技術(shù)如CRISPR/Cas9等的發(fā)展成熟，轉(zhuǎn)基因衰老模型也逐漸得到更廣泛的應(yīng)用。

3 衰老動物模型

3.1 脊椎動物模型

3.1.1 嚙齒動物模型

嚙齒動物是醫(yī)學研究中最常用的動物模型，大小鼠壽命較短、易于飼養(yǎng)繁殖和遺傳改造、環(huán)境因素可控，小鼠有99%的基因與人類同源，免疫、內(nèi)分泌和消化系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)功能與人類相似，Ackert-Bicknell等[3]通過縱向和橫斷面研究，發(fā)現(xiàn)衰老小鼠的認知功能、腎功能、血液功能和免疫功能下降等衰老表型與人類相似。嚙齒動物作為一類重要的實驗動物模型，無論是自發(fā)性、誘導性還是轉(zhuǎn)基因衰老模型均有廣泛應(yīng)用，但由于嚙齒類動物模型在藥代動力學方面與人類存在巨大差異，因此在進行藥物評價時仍需謹慎考量。

SAMP是由日本京都大學培育成功的自發(fā)性小鼠衰老模型[4]，SAMP共有9個亞系，病理表現(xiàn)有所差異，其中SAMP8是應(yīng)用最多的亞系，主要表現(xiàn)為學習記憶功能障礙并出現(xiàn)老年性淀粉樣變，但并未發(fā)現(xiàn)tau蛋白，因此常被應(yīng)用于改善學習記憶功能障礙藥物的評價。Vela等[5]發(fā)現(xiàn)DHA(docosahexaenoic acid)可以抑制JNK(Jun N-terminal kinase)活性改善SAMP8模型的認知功能障礙，有望成為治療AD的新方法。

早衰綜合征是一類罕見的遺傳性疾病，研究者一直致力于開發(fā)此類疾病的動物模型以探討其病理機制并進行藥物研發(fā)，如DNA修復缺陷Ercc1-/-和Xpg-/-模型以及Werner綜合征Werner-/-模型和Hutchinson-Gilford綜合征lmna-/-、Zmpste24-/-模型，這些早衰模型可引起壽命縮短和神經(jīng)退行性變等病理改變，同時也表現(xiàn)出多種器官生理性衰老癥狀，因此常應(yīng)用于抗衰老藥物評價和研究特定器官的衰老改變[6]。

針對衰老發(fā)生發(fā)展的復雜性機制，美國國家老齡化研究所從2004年開始啟動了干預測試計劃，旨在研究飲食干預對健康老齡化的促進作用。臨床前研究使用的重組近交系小鼠是由雌性CB6F1與雄性C3D2F1雜交形成，檢測的30種化合物有6種可明顯延長壽命，包括阿司匹林、雷帕霉素、去甲二氫化愈創(chuàng)木酸、雌二醇、阿卡波糖和普天登。為了更好地利用動物模型研究復雜性疾病，2002年國際復雜性狀聯(lián)盟啟動了遺傳多樣性小鼠(Collaborative Cross Mice)項目，建立了具有200多個品系的遺傳多樣性小鼠資源庫。遺傳多樣性小鼠更能反映人類個體差異，增加研究成果向人類轉(zhuǎn)化，是研究抗衰老藥物最佳的哺乳動物模型[6-7]。

衰老細胞累積在器官和機體衰老中發(fā)揮著重要的作用，P16是衰老細胞的重要標志物。Baker等[8]首次構(gòu)建了INK-ATTAC 轉(zhuǎn)基因小鼠，該模型可動態(tài)觀測P16在組織器官中的表達情況，可以在化學物誘導下清除表達P16的衰老細胞，證明了衰老細胞累積是衰老發(fā)生發(fā)展過程中重要驅(qū)動因子，為衰老機制研究和清除衰老細胞治療腫瘤和防治老年病開啟了新的思路[9]。

成年裸鼴鼠體型在小鼠和大鼠之間，是壽命最長的嚙齒動物(30年)，并且同種裸鼴鼠如達馬拉鼴鼠，生殖者比非生殖者壽命長兩倍，因此常對裸鼴鼠和其他嚙齒動物甚至人類進行基因組學比較醫(yī)學研究以得到長壽機制的線索[10]。

3.1.2 非人靈長類模型

非人類靈長類(nonhuman primate，NHP)與人類有相似的遺傳、生理、行為特征和衰老改變，是基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用之間的一個重要環(huán)節(jié)，其研究結(jié)果具有更高的參考價值，能夠最大程度實現(xiàn)實驗數(shù)據(jù)的外推，在衰老研究中NHP更多的被應(yīng)用于神經(jīng)退行性疾病的分子機制和衰老行為學及認知功能改變的研究。但由于NHP體型較大，來源緊張，壽命較長，而衰老或衰老相關(guān)疾病的病理表現(xiàn)通常出現(xiàn)在中年以后，因此進行實驗研究周期較長，需要耗費大量的人力和時間，這為實驗研究的開展增加了難度。

恒河猴是地理上分布最廣，也是生物醫(yī)學研究中應(yīng)用最多的NHP，大約93%的基因序列與人類相同，與嚙齒類動物不同，恒河猴的飲食和睡眠行為模式以及發(fā)育和衰老方式與人類相似[11]，在神經(jīng)退行性變、器官衰老、代謝綜合征、免疫缺陷等衰老研究中均有應(yīng)用，是目前存在的最為理想的衰老動物模型。

普通狨猴體型較小，易于飼養(yǎng)，壽命較恒河猴短，繁殖速度在NHP中是最快的，并且傳播動物性疾病的危險性較低，更為重要的是，現(xiàn)在已能夠建立穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因狨猴衰老模型[12]，如AD和帕金森疾病等神經(jīng)退行性疾病模型。

近期，Cramer等[13]發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的變化，非洲綠猴皮質(zhì)基因表達譜與AD病人相似，腦脊液中tau蛋白和β淀粉樣蛋白的變化過程與AD病人趨于一致，并且老年非洲綠猴也表現(xiàn)出AD患者的特征性病變——老年斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)，這些結(jié)果均說明非洲綠猴有望成為一種新型的研究AD的動物模型。

3.1.3 新型哺乳動物模型

目前一些其他壽命較長的哺乳動物也相繼成為衰老研究模型，如蝙蝠、犬以及中國樹鼩等，這些模型的出現(xiàn)為衰老研究提供了新的工具。蝙蝠體型小而壽命長，常將蝙蝠和嚙齒動物進行比較醫(yī)學研究探索長壽和抗衰老機制[14]。犬的基因信息如GC含量和端粒結(jié)構(gòu)，以及GH/IGF-1(growth hormone/insulin-like growth factor-1)通路與人類較為相似，最常用的衰老犬模型是比格犬，常被用于AD相關(guān)的藥物研究。最近，Hoffman等[15]通過大規(guī)模比較人類和伴侶犬的老年病發(fā)病率和死亡率，發(fā)現(xiàn)伴侶犬和人具有相似性。近期中國學者Fan等[16]發(fā)現(xiàn)中國樹鼩與人AD相關(guān)基因的序列保守性普遍高于小鼠，并且腦組織中β淀粉樣蛋白表達模式和神經(jīng)纖維纏結(jié)形成機制與人類相似，這些結(jié)果均提示樹鼩有望成為新型的研究AD的動物模型。

3.1.4 小型魚類模型

小型魚類占脊椎動物的一半，具有體型小、生長快、壽命短、易于繁殖飼養(yǎng)等特征，其中鳉魚和斑馬魚是重要的衰老動物模型。鳉魚的壽命較短，常被用于衰老有關(guān)基因的研究如IGF-1、Sir2基因以及微粒體運輸?shù)鞍祝琕alenzano等[17]首先在鳉魚研究中描述了白藜蘆醇的抗衰老特性。非洲青鳉魚是一種新型的衰老動物模型，老年非洲青鳉魚表現(xiàn)出端粒縮短、線粒體損傷等人類特征性衰老改變，Sahm等[18]發(fā)現(xiàn)老年非洲青鳉魚體內(nèi)參與合成線粒體呼吸鏈復合體的基因表達上調(diào)，而線粒體呼吸鏈復合體1被認為與壽命呈負相關(guān)。斑馬魚是最重要的模式脊椎動物之一，表現(xiàn)出與人類相似的衰老表現(xiàn)，如脂褐素的積累、學習記憶認知功能下降，以及氧化產(chǎn)物的積累和線粒體功能的下降等[19]，常用于高通量藥物篩選和抗衰老藥物的研究。雖然魚類器官與人類迥異，但魚類具有非常豐富的基因資源，也表達一些人類衰老相關(guān)基因，并且存在許多哺乳動物衰老標記，目前以水生動物為模型進行的衰老研究還在起步階段，對人類衰老的機制參考作用有待于進一步深入探討和驗證。

3.2 無脊椎動物模型

雖然哺乳動物是研究衰老最常用的實驗模型，但抗衰老藥物的臨床前研發(fā)通常始于線蟲、果蠅等無脊椎動物，緣于其具有結(jié)構(gòu)簡單、壽命較短、操作方便、易于培養(yǎng)觀察等特點，可以快速評估臨床前藥物的潛在療效。線蟲遺傳背景清楚、基因組測序已完成，主要有IIS(insulin/IGF-1 signaling)模型、飲食限制模型以及神經(jīng)退行性疾病模型，在抗衰老藥物篩選中也得到大量應(yīng)用。Heintz等[20]通過線蟲的飲食限制模型發(fā)現(xiàn)飲食限制可延長線蟲壽命，同時引起mRNA剪接因子1(splicing factor 1，SFA1)的過表達，SFA1通過抑制TORC1(mechanistic target of rapamycin complex 1)通路成分延長線蟲壽命，這些發(fā)現(xiàn)提示或可調(diào)節(jié)特定剪接因子活性延長健康壽命。這些結(jié)果為研究人類衰老機制提供了線索。

果蠅繁殖速度快、生命周期短、生理結(jié)構(gòu)簡單、品系豐富、遺傳背景清楚，與哺乳動物很多信號通路相關(guān)基因具有保守性，如IGF-1、phosphatidylinositide 3-kinase(PI3K)、protein kinase B(PKB)、AMPK和mTOR等，并且在神經(jīng)編碼方式、突觸傳遞機制、以及神經(jīng)疾病的發(fā)生等方面與哺乳動物具有相似性，因此常應(yīng)用于衰老機制和AD等神經(jīng)退行性疾病的研究[21]。雖然部分人類衰老特征能夠在無脊椎動物模型復制，但由于存在生理結(jié)構(gòu)和功能活性的差異以及重要病理機制的缺失，研究結(jié)果仍需建立更可靠的動物模型進行驗證以提高向人類轉(zhuǎn)化效率。

4 結(jié)語

目前有許多動物模型用以研究衰老，壽命較短的動物模型在研究衰老機制和抗衰老藥物的療效時具備優(yōu)勢，而與人類親緣關(guān)系更近的非人靈長類在研究老年病如二型糖尿病和神經(jīng)退行性疾病時則更有價值。同時，越來越多的物種和研究方法被用于衰老研究，并且卓有成效，比如非洲青鳉魚、非洲綠猴等新模型的應(yīng)用，P16報告小鼠INK-ATTAC轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建，以及不同壽命物種如海膽、蝙蝠和小鼠，甚至非洲象和北極頭鯨的比較醫(yī)學研究等等。研究者們致力于通過衰老動物模型來探索衰老的發(fā)生機制，雖然迄今為止尚未有任何一種動物模型可以完美復制人類衰老表型，但是隨著定向基因修飾等技術(shù)的發(fā)生發(fā)展以及不同壽命物種的聯(lián)合使用，人們對于衰老機制的認識也將更為深刻，也將為抗衰老藥物的研究以及新的藥物靶點的發(fā)現(xiàn)提供更好的依據(jù)。