豬脫細胞膀胱基質的研究現狀

邵 彬，焦海燕，李前勇，葛良鵬

(1.如東縣河口畜牧獸醫站，江蘇 南通 226463； 2.西南大學，重慶 402460； 3.重慶市畜牧科學院，重慶 402460)

動物組織經過剝離獲取有用部分，再經過除脂、除細胞、除抗原等后制作成的生物材料，統稱為細胞外基質(extracellular matrix，ECM)。豬脫細胞膀胱基質(urinary bladder matrix，UBM)屬于細胞外基質中的一種。20世紀90年代開始有學者研究發現[1]UBM具有無侵蝕性、組織相容性好、能誘導組織再生、形成瘢痕少等優點，且還能誘導血液中游離的多種成體干細胞[1]向植入部位富集，并分化為神經、血管、平滑肌[2]、心肌、鼓膜、肌腱以及氣管等多種有效組織，從而達到組織修復的目的，是盆底高分子補片的理想替代材料。相較于其他脫細胞基質材料，UBM在器官損傷修復過程中，發揮調節細胞生長、分化和遷移的作用。同時，UBM在經分層、脫細胞、消毒及凍干等處理后比其他ECM材料在結構上更易保留完整的基底層[3]，對參與組織修復的骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)有獨特的較強親和力和粘附力[4]。

1 UBM的結構與功能

有形態學的證據表明，來源于不同器官的生物支架材料都有自己特有的三維結構，如UBM，其顯微和超微結構有特征性的矩陣，在調節細胞的行為、控制細胞遷移到支架的能力和影響組織特定的細胞表型上扮演了重要作用[5]。一個完整的基底膜可以很大程度防止體外細胞滲透到基礎矩陣，不規則的纖維表面結構可以在不同細胞類型的選擇和細胞滲透到支架材料方面發揮促進作用。UBM還可以顯著影響人類胚胎干細胞的分化途徑和祖細胞數量的選擇[6]。

UBM支架的膠原纖維結構在其生物力學上扮演著關鍵的角色。膠原纖維拉直后有典型的褶模式，并且可以向旋轉的方向延伸。組織膠原纖維隨力的旋轉是可逆的，直到達到UBM所能承受的最大應變量，膠原纖維的空間排列變化可以使用簡單的仿射模型進行預測[7]。但隨著外力的不斷增大，空間結構的旋轉變化就是永久性的，不能再用仿射模型進行預測，這樣就會導致UBM支架整體生物力學行為的變化。

不同的ECM是由不同器官內的組織所分泌，它們具有不同的結構、功能和組成分子。因此，不同ECM的物質組成和分布取決于它的組織來源。UBM具有生物支架材料的廣泛特性，目前被用作典型的生物支架材料。UBM的干重有超過90%的是膠原蛋白，有少量的III、IV、V和VI膠原蛋白，絕大多數是I型膠原蛋白；此外，它還含各種各樣的葡糖氨基和葡聚糖等有機物，包括肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸軟骨素、透明質酸等。目前的研究證明UBM也含有各種生長因子，例如轉化生長因子-β(TGF-β)、基本成纖維細胞生長因子(bFGF)和血管內皮生長因子(VEGF)[8]。其中，一些生長因子在體內可以保持其生物活性，即使終端滅菌后其生物活性也會長期存在。總之，細胞外基質和多種多樣的復雜分子組成的生物支架材料植入組織和器官后，可以給修復和重建所需的細胞以更好的支持并發揮功能。

2 UBM的制備方法

豬膀胱需要經過幾個處理步驟才能制備成UBM支架材料，這幾個處理步驟可以顯著影響材料的結構、對宿主的反應類型和修復重建組織的能力。UBM支架材料需要通過使用物理的機械方法去除多余的組織結構如粘膜層、漿膜層和肌層，再經過脫細胞等步驟，放入冷凍真空干燥機凍干和終末消毒，最后制成UBM。每一個處理步驟都可以改變UBM生物支架材料的結構完整性和架構，這些改變都會影響UBM的機械和材料性能。

2.1 去細胞

來源于同種異體或異種動物組織的ECM支架材料都含有細胞，其細胞膜和細胞內的組件具有抗原表位，有效的清除這些抗原表位可以減少或避免植入組織或器官的不良免疫反應。異種或同種異體的細胞抗原是導致植入組織或器官不良炎癥反應和明顯免疫介導排斥的主要原因[9-11]。但某些抗原因含量少和分布不集中很少發生不良免疫反應，如豬UBM上的3-半乳糖，并不能激活補體或綁定IgM抗體[12]。使用適合的方法去細胞，最終目標是清除UBM生物支架材料上所有的細胞成分，且不能破壞UBM的機械完整性和一系列的生物活性。去細胞的常用方法包括物理法、化學法及物理化學相結合法幾種。聲波降解、攪拌和凍融可用來破壞細胞膜，釋放細胞內容物和促進清除UBM上的細胞殘余。常用的去細胞的方法并不足以實現完整去除UBM上的細胞，這樣，UBM支架材料上會保留一些DNA[13]。雖然從理論上講這些方法去細胞會影響到UBM的結構和組成，但也能保護UBM本身所具有的優秀機械性能和良好的生物性能。研究發現，一些促進去細胞的化學試劑能破壞某些組織的膠原蛋白，從而降低組織的機械強度，但對其他組織的膠原蛋白無影響[14]。因此，UBM的去細胞方法需要不斷研究與優化，探索和發展出更多的UBM機械和生物性能影響最小的方法。

2.2 水合作用

UBM生物支架材料在整個去細胞和滅菌過程中保持水合狀態，材料內的離子和水分子發生靜電作用，這種靜電作用使離子與水分子以離子對的形式存在，可以防止組織架構的變化，如膠原纖維與各種分子之間形成的物理聯系。然而，UBM在水合狀態下處理的主要缺點是會有可溶性的生長因子如VEGF和bFGF等的連續浸出，導致材料的壽命和生物性能降低。所以在目前的技術手段下還難以防止這些生長因子的丟失，希望以后通過技術的革新進步解決這一問題，更大限度的保留其性能。

2.3 脫水

UBM生物支架材料通常使用冷凍真空干燥的方法脫水，脫水后使得支架更容易處理并能限制生長因子的向外流失。凍干過程中，水在低溫和低壓力狀態下從UBM上升華出去。冷凍真空干燥法可以保護UBM的機械和生物性能，并且可以使UBM長期儲存。但冷凍真空干燥法雖可以延長UBM保質期，卻對材料的強度值無影響，也會改變膠原纖維形態[15]。冷凍真空干燥法可以顯著減少UBM的厚度，使纖維形態更為致密。脫水還可以使UBM的超微結構發生變化，繼而影響其在植入體內后的細胞附著、降解速率和細胞生長繁殖的能力[16]。

2.4 終端滅菌

研究表明，終端滅菌可以對UBM支架的機械性造成不利的影響[17]。UBM暴露于環氧乙烷、γ輻照(20 kGy)和電子束輻照(22 kGy)時會降低單軸和雙軸的機械性能[17]。但在低劑量的γ輻照(< 15 kGy)后，UBM的機械強度會有所增加[18-19]。這些變化與膠原蛋白鏈的斷開有關，隨著輻照劑量增加，膠原蛋白鏈斷開增加，繼而其機械強度會下降。一般對UBM采用γ輻照(25 kGy)進行終端滅菌。

3 UBM的應用

3.1 粉狀UBM支架

凍干的UBM可以粉碎成粉末或顆粒形式[20]。粉末形式的UBM支架可以通過微創技術(如針注射)注入患部制造成三維支架。UBM在粉碎后仍保留原本的超微結構和三維表面特征表。凍干UBM粉末制成的懸浮液已經成功地用作注射支架在臨床治療尿失禁[21]。粉末形式的UBM生物支架材料也可以用于局部組織損傷或與其他物質制成混合支架用于臨床治療。由于粉末形式的UBM提供承載能力很有限，所以使用時需考慮粉末顆粒的大小、患部面積等，這樣才能更有效的治療和修復受損的組織。

3.2 凝膠狀的UBM支架

凝膠狀的UBM生物支架材料可以在適當時候充當細胞運載工具，進而擴大其臨床應用的范圍和增加治療效果。根據凝膠的流變特性可以設計成類似的組織進行治療。凝膠形式的UBM可以保持生長因子的活性進而使其具有與普通UBM相同的生物活性。早期的研究已經表明，凝膠形式的UBM能夠支持多種細胞的生長和在體外的分化，如肌母細胞、心肌細胞、平滑肌細胞和內皮細胞等[22]。

3.3 UBM組成的混合支架

UBM生物支架材料受組織本身特性的影響，包括形狀、機械性能等。UBM生物支架材料性能也受制造過程(即機械去細胞和化學去細胞)和動物的年齡與健康狀況的影響。但可以通過一些物理的方法對UBM進行操縱來改變它的機械性能。例如，可以通過增加UBM的層數來增加薄板形UBM的最大承受力[23-24]。

人工合成支架材料具有穩定和可重復再生產的優勢，然而，人工合成材料缺乏生物活性不能快速幫助受損組織重建，也不能在體內根據需要降解。結合UBM與人工合成材料的優點，即機械性能和生物性能，制作成混合材料，例如結合UBM與聚尿素可創建彈性混合支架材料剛度、強度都有所增加，且當入體內時，混合支架材料的降解速度比天然的UBM慢[25]。

3.4 UBM的修飾

在實際應用中發現，天然的ECM植入人體后降解過快，易吸水膨脹，受熱會變形，承受器官擠壓和牽拉的能力有限，使用一段時間后就不能繼續承受牽拉器官的重力，從而導致器官再次回到錯誤的部位，使得疾病復發。經研究發現天然UBM通過與交聯劑交聯后再使用，很多性質得到了優化，如可以使熱穩定性提高，水洗后形態基本會保持穩定，抗酶解的能力提升，抗拉力和沖擊力的能力也大幅提高，機械性能增強。對細胞的識別能力也有所提升，能夠使細胞更加牢固的附著和適應生物材料，能改善植入部位組織的炎癥反應和異物反應[26-27]。

在UBM修飾過程中所使用的交聯劑，應是低免疫原性、低毒、低抗原性，對人體有較好的生物相容性，并且能夠引導細胞的生長、繁殖和分化。目前使用的交聯劑有多巴胺、碳化二亞胺、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、戊二醛、京尼平等。研究發現EDC/NHS交聯的材料有較高的交聯度，幾乎對細胞沒有毒性，有良好的生物相容性和良好的細胞相容性[26, 28]。經京尼平交聯的材料抗酶解能力最強，具有較好的吸水能力，可有效的促進新生血管的生長，誘導真皮的生成并且可有效控制[29]。經戊二醛交聯的材料對細胞具有一定的毒性，但抵抗傷口收縮的能力較強，能夠誘導傷口附近的新生組織向著傷口內部生長[30]。

交聯可以減少UBM支架在體內降解的速率，早期的研究發現海洋貽貝分泌的黏附蛋白在水的參與下可以使貽貝緊密附著在海洋固體物質上，這種黏附蛋白含有3,4-二羥基苯丙胺序列，多巴胺有類似的結構序列，這就為科學家們提供一個新的平臺用以改造生物材料的性能[31]。有研究報道稱多巴胺(dopamine)可以在水溶液里發生氧化-交聯反應，使生物材料的表面形成一層強力黏附性的聚多巴胺復合膜。在水溶液里多巴胺的鄰苯二酚基團可以發生氧化反應，形成多巴胺醌化合物，此化合物含有鄰苯二醌結構。多巴胺醌化合物與多巴胺可以發生反歧化反應，生成半醌自由基，之后繼續反應生成交聯鍵，同時可以在固體材料的表面生成一層強力黏附性的復合膜[32-33]。有研究報道表明，多巴胺強力粘附在固體材料表面上的機理是源于多巴胺的氨基官能團和鄰苯二酚，這種結構可以和材料表面發生非共價和共價的相互作用，繼而可以使聚多巴胺復合膜緊密粘附在固體材料的表面上[34-36]。已有研究結果表明，聚多巴胺復合膜表面含有非常多的官能團，它們可以與有些生物分子和含有氨基、氫硫基等官能基團的聚合物發生反應，對固體材料進行進一步的修飾，提高固體材料的性能[34-36]。

近幾年來，在器官發育領域的多項研究報道初步揭示了層粘連蛋白(laminin)的干細胞富集機制：層粘連蛋白通過其LG功能域與干細胞特有受體亞型——integrinα6β1結合，能使胚胎干細胞及神經干細胞等多種成體干細胞[37-40]向其趨化并粘附。巢蛋白(nidogen)結合于層粘連蛋白的γ1-LEb3域，對層粘連蛋白的功能存在重要的調控機制。以神經干細胞為研究對象的報道，發現當上調巢蛋白的表達后，會通過激活Notch1通路促進干細胞向層粘連蛋白趨化和粘附，并抑制干細胞的分化，這種功能可被通過干擾層粘連蛋白的γ鏈與巢蛋白的結合而阻斷[41]；并且巢蛋白對于層粘連蛋白分子彼此間的連接具有重要作用。所以可以在UBM上添加層粘連蛋白/巢蛋白，這兩種蛋白相互作用增強它們的自身功能，這樣就有助于提高UBM材料的生物性能，也有助于提高材料的力學性能，使UBM材料植入組織后能夠吸引更多的干細胞聚集和分化，在器官位置變動時可以有效的限位保證器官正常的工作，利用這兩種蛋白的生物功能加速修復受損的組織和器官，受損組織和器官能夠很快的恢復正常的狀態，保障人體的健康，所以選擇這兩種蛋白修飾UBM是明智的。

3.5 UBM的細胞種植

應用組織工程方法修復人體受損組織或器官時所用的各類功能細胞統稱為種子細胞。種子細胞有不同的類型，依據種子細胞是否來源自患者本身，可分為自體種子細胞和異體種子細胞；根據種子細胞的分化狀態又可分為分化成熟的成體細胞和具有分化潛能的干細胞，其中的干細胞又包括胚胎干細胞和成體干細胞。種子細胞在植入人體后可以分化成纖維細胞、神經元、上皮細胞和脂肪細胞等，可以彌補人體受損部位干細胞的不足，極大的促進受損組織或器官的恢復。現代醫學可以把種子細胞接種到UBM上，種子細胞可以很好的附著在UBM上，當把UBM植入人體受損的部位后，種子細胞可以以材料為平臺生長繁殖分化，進而修復受損的組織或器官。因生物材料本身攜帶很多種生長因子，所以生物材料也促進種子細胞的生長繁殖和分化，進一步促進受損組織或器官的修復。目前已應用于皮膚更換和傷口修復、 多種類型的疝修補術[42]、腹壁移植、結腸和直腸手術、食道修復、尿失禁治療、膀胱擴張與骨盆器官脫垂修復、硬腦膜的修復與軟組織修復等。

4 UBM的實驗應用

Gilbert等人[43]使用UBM制成生物材料補片用于修復氣管病損，研究表明UBM只適用于小范圍氣管損傷，不能用于長形大范圍損傷修復。袁銘[44]實驗發現UBM可以大面積替代犬的損傷膀胱，并且有利于犬膀胱的重建。魏桂枝等[45]在UBM上添加層粘連蛋白有利于BMSCs的增殖和向平滑肌的分化，使大鼠的尿失禁癥狀得以改善也增加了在體內的降解時間。楊鏵琦等[46]制作骨髓間充質干細胞-豬脫細胞膀胱基質-聚丙烯復合網片，植入大鼠體內后生物相容性好，只有輕微的炎癥反應，張力提升，是治療骨盆腹腔脫垂的良好候選材料。目前UBM材料的使用僅限于試驗階段，離臨床應用還有一段距離，還有待廣大學者的進一步研究。

5 展望

現在已經認識到，豬脫細胞膀胱基質是一個優秀的生物支架材料可適用于許多疾病的治療。成功使用UBM作為治療材料在很大程度上取決于我們理解原生UBM結構與生物功能關系的能力。但植入人體后降解速度過快是其缺點。未來的研究方向是使用創新的思維和方法，使UBM的生物性能和力學性能都有所提高更有利于治療疾病。

隨著科學技術的發展，生物材料也在不斷地進步，目前已經不只是醫學而是依靠多學科的共同合作發展。加之道德倫理上的問題沒有就解決所以克隆器官的應用還不能開展，目前生物材料依然是重要的人體組織替換或修補材料。隨著經濟的發展，人民對高精尖生物材料的需求也在不斷的增加，生物材料的發展具有非常光明的前景。