內皮祖細胞生物學特性的研究進展

田 玲，周 諾

(1.浙江省立同德醫院口腔科，杭州 310000； 2.廣西醫科大學附屬口腔醫院口腔頜面外科， 南寧 530021)

內皮祖細胞自1997年被Asahara教授[1]發現以來，與內皮祖細胞相關的研究接踵而至，學者們發現內皮祖細胞可在多個領域中發揮重要作用。內皮祖細胞主要來源于骨髓，外周血及臍帶，其中骨髓中含量最高，且骨髓中內皮祖細胞的增殖能力是外周血的50倍[2]，但Epcs從骨髓中獲取較難，培養基昂貴，如何促進其擴增及增強其生物學特性一直是一大難題。近年來，研究者們在研究中發現了多種促進內皮祖細胞增殖、遷移和動員等相關生物學特性有關的信號因子及信號通路，祖國傳統醫學中的多種中藥亦發現對內皮祖細胞的功能有良好的促進效果，很多疾病通過改善內皮祖細胞的功能特性達到了良好的治療效果，現將相關文獻進行綜述。

1 促進內皮祖細胞生物學特性的細胞因子

影響內皮祖細胞功能特性的細胞因子較多，這些細胞因子一方面給內皮祖細胞提供營養，一方面調控內皮祖細胞的增殖、遷移、動員能力，近年來人們研究較多的有以下幾種：

1.1 血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)

血管內皮生長因子家族由以下成員組成：VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F、PLGF。最近，該家族又加入了內分泌腺衍生的血管內皮生長因子(EG-VEGF)。VEGF的受體稱為VEGFR，主要有以下幾種：VEGFR-1、VEGFR-2(又稱KDR)、VEGFR-3(又稱Flt-4)。VEGFR-1和VEGFR-2主要在血管內皮細胞上表達，VEGFR-3主要在淋巴內皮細胞上表達。血管內皮生長因子(VEGF)是一種重要的促血管生成活性的生長因子，對內皮細胞具有促進分裂和抗凋亡作用，還可增加血管通透性，促進細胞遷移，它在調節正常和病理性血管生成過程中起積極作用，對內皮祖細胞的生長也存在重要作用。張文斌等[3]用含不同濃度的VEGF的培養基培養內皮祖細胞，發現用較低濃度的VEGF培養內皮祖細胞時，內皮祖細胞的粘附能力、遷移能力、增殖能力等都得到了增強，但VEGF濃度較高時增強效果反而不明顯[4]；崔斌等[5]用含VEGF的培養基培養內皮祖細胞后，發現其能促進Epcs的數量及分泌eNOS的功能。王偉等[6]轉染了VEGF基因到Epcs后，發現Epcs分泌VEGF的能力和內皮祖細胞的增殖能力均得到了提高。

1.2 缺氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor 1, HIF-1)

HIF-1是一種調節新生血管形成的轉錄因子。HIF-1α是HIF-1的α亞單位，是調控HIF-1轉錄活性的缺氧傳感器。缺氧時，脯氨酰羥化酶(PHDs)的活性受到抑制，進而抑制HIF-1α的泛素化，導致HIF-1的激活[7]。HIF-1還能促進新生血管化和神經發生，有利于神經從缺血性損傷中恢復。但是，在腦缺血的急性階段，過度激活的HIF-1會損害血腦屏障。Liu等[8]用慢病毒沉默了小鼠HIF-1α基因，發現其降低了內源性和外源性骨髓來源的內皮祖細胞的歸巢功能，并發現其可能導致了VEGF-A、VEGF-A/FLK-1、NRP1和DLL4表達的降低，推測HIF-1α可能通過CXCL12/CXCR4和Hmg1參與EPCs歸巢，并通過VEGF-A/flk1-nrp1/dll4信號通路促進骨髓來源的EPCs形成新生血管。姜萌等[9]用質粒轉染HIF基因到Epcs中，使Epcs過表達HIF，檢測后發現HIF基因轉染成功后Epcs表達FLK、VEGF、eNOS等下游蛋白均增多。

1.3 基質生長因子(stromal cell-derived factor- 1, SDF-1)

SDF-1是由間充質干細胞分泌的一種細胞因子，是一種重要的調節干細胞和祖細胞進出骨髓微環境的細胞因子，血清中SDF-1的濃度與循環中內皮祖細胞的含量關系較密切。有學者比較發生了高風險非損傷性腦血管和低風險非損傷性腦血管的兩組患者外周血中SDF-1含量和Epcs數量及遷移情況，發現發生了高風險非損傷性腦血管組的患者血清中SDF-1濃度低于低風險非損傷性腦血管組，而EPCs的增殖和遷移率也低于低風險非損傷性腦血管組，對于短暫性腦缺血發作和輕微腦卒中患者，可用循環EPCs和血清SDF-1濃度來預測高風險非損傷性腦血管發生，他們認為循環內皮祖細胞增殖和遷移的減少可能與高風險非損傷性腦血管發生有關，表明血清中SDF-1的濃度與循環中內皮祖細胞的含量存在一定關系[10]。

1.4 去甲腎上腺素(norepinephrine, NE)

有研究證明NE可促進內皮祖細胞的增殖、遷移能力，姜其鈞等[11]給左下肢缺血的實驗組小鼠持續性注入去甲腎上腺素，對照組給予生理鹽水注射，結果發現實驗組小鼠外周血、骨髓、脾臟的內皮祖細胞數量較對照組均上升，并證明NE是通過Akt-eNOS信號通路調節了此過程。

還有很多細胞因子也可影響內皮祖細胞的生物學特性，如Chen等[12]發現BMP-2可促進Epcs的遷移和成管，有研究發現整合素α6的上調與 Epcs的血管生成功能有關[13]。

2 信號通路

目前許多正在進行的工作集中在通過操縱信號通路來改變細胞內蛋白的表達，如操控Wnt/β-catenin和骨形態發生蛋白通路，減少了干細胞的異質性，促進了干細胞移植治療的可行性[14]；激活SDF-1/CXCR4信號通路調控內皮祖細胞動員到受損傷區域等。當前研究較多的通路有以下幾條：

2.1 基質衍生因子/趨化因子受體-4 (SDF-1/CXCR4) 信號通路

SDF-1，即基質衍生因子-1，又稱 CXCL12，屬于CXC趨化因子家族。它的N段是受體結合所必需的，特征是7個跨膜結構域與G蛋白結合，是結合及激活趨化因子受體的區域。SDF-1的受體是CXCR4，CXCR4是由352個氨基酸分子組成的蛋白質，當CXCR4被激活時，它會將多種信號轉換成對細胞的趨化，分化，凋亡等生物功能的控制。CXCR4表達在多種細胞上，包括淋巴細胞，單核細胞等血細胞，造血干細胞及胚胎干細胞，在內皮細胞上也有表達，已有研究證明其激活無論在體內或體外均能促進血管形成[15]。

SDF-1/CXCR4軸在胚胎發育過程中起著至關重要的作用，主要功能之一是調節胚胎發育過程中祖細胞的運輸，調控細胞趨化和歸巢到機體受損傷的部位[16]。SDF-1/CXCR4對Epcs的影響一方面在于SDF-1吸引了Epcs從骨髓動員到外周血，另一方面在于目前公認內皮祖細胞表達CD34，Askari等人[5]研究發現CD34+細胞表達CXCR4，而SDF-1可誘導CD34+細胞遷移和血管生成。

近年來，此信號通路介導的祖細胞動員還被廣泛應用于臨床研究中，如運用于器官移植、球囊血管成形術或支架植入術后觀察到的血管損傷誘導的再狹窄模型中進行研究[17-18]。

2.2 磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶 (PI3K/AKT)信號通路

PI3K是由一個110×103大小的催化亞基(p110)和一個85×103大小的調節亞基(p85)組成的二聚體。PI3K下游可影響細胞凋亡，細胞分化，細胞內囊泡轉運等。P110亞基在細胞膜內表面產生pip3，pip3可吸收pdk1，然后pdk1磷酸物激活AKT，進而激活下游通路。AKT，即絲氨酸/蘇氨酸激酶，稱作蛋白激酶B或PKB，是一種原癌基因，AKT激酶家族包含三種亞型，AKT1、AKT2、AKT3，與細胞生存生長有著密切關系。其中AKT1是最多的，由pdk1和pdk2磷酸化。AKT2在對胰島素起反應的組織中表達，如肌肉組織，它對葡萄糖代謝起著重要作用。Akt3在腦和睪丸中表達較多。PI3K/AKT的下游可調節eNOS的表達。NO主要由eNOS合成， eNos通路能促進eNos的表達，從而使NO的分泌增多，刁玉剛等[19]將eNOS基因轉入大鼠的Epcs后，發現培養基中NO含量明顯增高。

Cao等[20]對糖尿病小鼠和健康小鼠的Epcs分別進行培養，MTT法結果表明糖尿病患者Epcs的活力低于健康小鼠，用西紅花酸治療后，糖尿病組Epcs的增殖能力得到了改善，且遷移能力得到了提高，研究人員發現此現象與PI3K/AKT信號通路有關，西紅花酸增加了pAKT和p-eNOS的表達，從而激活了PI3K/AKT/eNOS信號通路，恢復受損傷Epcs產生eNOS的能力。Li等[21]使Epcs的LncRNA WTAPP1基因分別過表達和沉默，發現LncRNA WTAPP1可通過PI3K/AKT調節MMP-1的表達，積極調節Epcs的遷移、侵襲功能和體內外成管能力。

馬穎等[22]用差速貼壁法培養內皮祖細胞，檢測PI3K、AKT、AC133、vWF等的mRNA及蛋白的表達水平，發現AC133, PI3K、AKT的表達隨時間推移逐漸減弱，vWF的表達沒有變化，提示PI3K/AKT信號通路參與了內皮祖細胞分化為內皮細胞的過程，可能促進了內皮祖細胞的分化。

2.3 Wnt信號通路

Wnt信號通路是由Wnt蛋白與胞膜上的受體結合激活，根據其是否有β-catenin分為經典Wnt信號通路和非經典Wnt通路。劉凱等[23]用機械力及成血管誘導液共同刺激內皮祖細胞，發現β-catenin及下游的VEGFA蛋白表達均顯著增強，同時PCR結果顯示與Wnt信號通路相關的一系列相關蛋白的基因表達亦增強。崔斌等[24]用氯化鋰抑制Wnt信號通路負性調控蛋白GSK-3的表達，以激活Wnt信號通路，發現Wnt通路關鍵調控蛋白β-catenin及下游Cyclin D1表達均增加，內皮祖細胞的增殖也明顯增加；余濤[25]在體外構建沉默Wnt3a基因的重組質粒，用脂質體作為介導將質粒轉入小鼠內皮祖細胞中，發現沉默了Wnt3a的小鼠內皮祖細胞的增殖受到了明顯抑制。Wnt非經典通路亦被研究發現可調控內皮祖細胞的生物學特性，楊棟等[26]在培養內皮祖細胞的培養基中加入外源性的Wnt5a，發現內皮祖細胞的增殖能力、遷移能力和成管能力均增加。

還有很多信號通路也被報道與Epcs有關，如李小林等[27]發現NOTCH信號通路可促進內皮祖細胞的增殖分化，尹華曦等[28]發現雌激素可通過MAPK通路促進內皮祖細胞的增殖和遷移能力，戰麗麗等[29]發現補腎活血中藥可通過激活MMP-9信號通路促進內皮祖細胞從骨髓動員到血液循環。

3 中藥對內皮祖細胞的影響：

近年來很多學者發現中藥可作為內皮祖細胞功能的調節劑調節內皮祖細胞的功能，研究較多的主要有以下幾種：

3.1 黃芪多糖

吳青等[30]用含黃芪多糖的M199培養基培養內皮祖細胞，發現800 mg/L的黃芪多糖能顯著促進Epcs的增殖，且此現象能被PI3K阻斷劑LY294002阻斷，Western blot結果提示黃芪多糖能促進Epcs的Akt、eNOS磷酸化，表明黃芪多糖可能是通過此通路促進內皮祖細胞功能。

3.2 補腎活血中藥

戴國華等[31]每日用補腎活血中藥給心肌缺血的小鼠灌胃，對照組僅給予生理鹽水，一個月后取兩組小鼠的外周及骨髓的Epcs進行培養，發現給藥組Epcs的數量較對照組明顯增多，同時VEGF、SDF-1α的表達亦增多，此中藥可有效促進Epcs的增殖及相關功能。

3.3 丹酚酸

封亞麗等[32]從健康人的外周血中分離出Epcs并進行培養，7 d后換成含丹酚酸的培養基進行培養，然后對內皮祖細胞的增殖、分化和旁分化能力進行測定，發現丹酚酸處理后的內皮祖細胞的增殖能力及培養基上清液中VEGF、SDF-1 及 IL-8 水平均增加。劉璐菘等[33]做了類似的實驗，也得出來了相似的結果，表明丹酚酸可促進內皮祖細胞的增殖功能及自分化、旁分化功能。

3.4 姜黃素

駱明炎等[34]用不同濃度的姜黃素處理內皮祖細胞，發現低濃度姜黃素對內皮祖細胞的增殖、遷移、粘附等功能有促進作用，高濃度則相反，并發現適宜濃度的姜黃素可能抑制骨鈣素的表達，從而改善心血管患者的血管功能。

3.5 鹿茸

賀怡然等[35]發現鹿茸可促進骨髓來源的內皮祖細胞修復內皮的功能，他們給予下肢缺血的小鼠分高、中、低三個劑量進行灌胃給藥，然后抽取小鼠的腹主動脈血進行培養，發現高劑量的鹿茸能顯著促進Epcs的增殖和VEGF、NO的表達，從而促進內皮修復，改善機體的缺血狀況。

3.6 柚皮苷

趙志虎等[36]用不同濃度的柚皮苷培養來自骨髓的Epcs，發現500 μg/mL的柚皮苷能顯著促進內皮祖細胞增殖及SDF-1α，CXCR-4等基因及蛋白的表達，而加入柚皮苷組與加入CXCR-4抑制劑及PI3K抑制劑組比，成血管能力上升，表明柚皮苷促進內皮祖細胞的增殖及生物學特性可能與SDF-1α/CXCR-4/PI3K/AKT功能軸有關。

目前，中藥促進內皮祖細胞生物學特性的影響機制還不甚了解，未來還需做更多的研究，方能更恰當的將中藥運用到內皮祖細胞的調節中來。

4 內皮祖細胞在臨床疾病治療的研究進展

近年來學者們發現有很多疾病可通過改變內皮祖細胞生物性能來進行治療或改善癥狀，如光療促進內皮祖細胞的生物學性能:有研究者發現光療能顯著促進Epcs動員到循環中，他們運用光療治療患有呼吸窘迫綜合征的患兒，發現光療可增加循環中Epcs的數量，促進Epcs增殖，成管，趨化等，改善肺的功能，從而改善了其呼吸功能，未來有望通過此方法改善患有呼吸窘迫綜合征患兒的呼吸情況從而達到預防支氣管肺發育不良[37]。還有研究者同樣用光療治療患有嚴重高膽紅素血癥的嬰兒，發現光照促進Epcs的動員，證明光療能促進Epcs在循環中富集，并能影響Epcs的生物學特性，而在體外實驗中發現光療后，Epcs的遷移和成管能力也會增加[38]。Epcs還與糖尿病有關，Epcs參與了內皮功能障礙和新生血管的形成，故內皮祖細胞功能紊亂可能是糖尿病引發的血管并發癥的基礎。許多研究中表明糖尿病患者的Epcs功能受損[39]，故目前很多糖尿病治療的研究都著力于恢復Epcs功能上，Cao等[20]用含西花黃素的培養基培養糖尿病小鼠骨髓來源的Epcs，發現原本受損傷的Epcs的活力，遷移能力以及eNOS生成能力均得到恢復，他們認為西花黃素有望作為潛在的治療糖尿病的藥物。Simin 等[40]發現胰島素聯合二甲雙胍治療能促進糖尿病病人的Epcs進入循環的量，同時伴有Epcs增殖、遷移、分泌、克隆和成管活性的增加，從而保護了糖尿病患者的血管，胰島素是一種對Epcs至關重要的生長因子，它能刺激內皮細胞的血管形成，修復內皮損傷。但二甲雙胍需與胰島素共同作用，僅使用二甲雙胍則會抑制血管形成，降低血清中VEGF的量。

5 展望

與Epcs相關的研究仍在繼續開展，希望未來能有更多更有效的細胞因子、信號通路及其他藥物被發現，具體機制也能被研究的更清楚，以使內皮祖細胞實現在體外高效擴增，生物學特性得到顯著增強，與它有關的疾病能得到更好的改善甚至治愈，Epcs亦可以運用到更多的領域中。