小鼠痤瘡模型研究進展

陳爾凈，劉曉偉，盧 丹，黃敏敏，葉陳庚，黃學嶸，陳永欣，周艷平

(1.廣西中醫藥大學賽恩斯新醫藥學院，南寧 530200； 2.廣西中醫藥大學基礎醫學院生理學教研室，南寧 530200)

痤瘡(acne)是一種由毛囊皮脂腺異常引起的慢性炎癥性疾病，青少年對其應答率為80%[1-2]。嚴重的痤瘡與社交障礙、生活質量下降、抑郁和自尊心下降有關[3]。痤瘡是一種常見的疾病，其發病機制具有多因素、多態性的特點。目前，大部分研究認為痤瘡的發病與角化細胞增生、神經肽P物質(substance P， SP)表達異常、雄激素水平升高、皮脂腺功能亢進、丙酸桿菌 (propionibacteriumacnes，P.acnes) 菌群異常誘導機體免疫反應和局部炎癥的發生有關[4]。有研究表明，痤瘡患者皮脂成分變化主要包括白細胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、CD3+和CD4+T細胞水平升高，早期亞臨床痤瘡病灶(微球蛋白)，脂肪酸比例升高[5-8]。小鼠痤瘡模型是目前研究痤瘡發病機制、臨床抗痤藥物的主要痤瘡模型之一，與其他的動物相比，小鼠具有易飼養、實驗成本低、容易獲得等優點。本文旨在通過對近幾年國內外的小鼠痤瘡模型的建模方法、適用范圍及優缺點進行簡要歸納，以利于在痤瘡發病機制、抗痤藥物等相關研究中選擇適合的小鼠模型。

1 P.acnes誘導模型

1.1 小鼠炎性痤瘡模型

P.acnes是革蘭陽性厭氧菌，是痤瘡的主要病原菌。小鼠耳廓皮內注射P.acnes菌懸液造成小鼠耳部感染，可模擬P.acnes菌群異常而引起的痤瘡外部表現及炎性反應，但痤瘡丙酸桿菌滅活后則無類似反應[9]。小鼠體內有低濃度的甘油三酯(triglyceride，TG)，TG可被P.acnes脂肪酶分裂成甘油和脂肪酸，從而促進P.acnes生長[10]。Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)蛋白家族的模式識別受體已被鑒定為P.acnes應答受體，TLR2在P.acnes感染的角質形成細胞、單核細胞和巨噬細胞中的表達升高。TLR激活促進了促炎細胞因子、趨化因子、前列腺素和白三烯的產生[11-12]。P.acnes通過依賴于TLR2的途徑誘導單核細胞因子的產生，還通過TRL2誘導白細胞介素-12(interleukin-12， IL-12)P40啟動子活性的激活，誘導原代人單核細胞產生IL-12和白細胞介素-8(interleukin-8，IL-8)。此外P.acnes還可通過生成多種酶類物質分泌大量活性產物，導致毛囊壁被破壞引起炎癥反應[13]。因此，小鼠耳內注射P.acnes的模型可代表毛囊破裂后的肉芽腫型痤瘡炎癥。

用PBS緩沖液配置濃度為6×107cfu/μL的P.acnes菌懸液，并皮內注射到8周齡的雄性ICR小鼠的右耳，以誘導小鼠急性耳水腫，建立小鼠炎性痤瘡模型[14]。該模型表觀可見小鼠的耳部腫脹、發紅和紅斑，鏡下病理表現為巨噬細胞、CD45+白細胞和Ly6G+中性粒細胞等浸潤性炎癥細胞的數量顯著增加[15]。該模型可導致小鼠耳內局部細菌定植和炎癥，這與人類痤瘡病變相似，且因其簡單方便、造模成功率高，常用于P.acnes導致痤瘡的機制及抗P.acnes藥物研究。然而小鼠鼠耳較小，建模過程容易貫穿鼠耳，這影響了對模型的表面觀察及鼠耳厚度檢測。另外有研究表明，小鼠耳朵炎癥反應引起的繼發性改變是有限的，在小鼠背側注射P.acnes更容易觀察炎癥性痤瘡的初始過程[16]。

1.2 小鼠人造皮脂痤瘡模型

小鼠人造皮脂痤瘡模型是通過聯合應用P.acnes接種和局部應用與人皮脂成分極為相似的人造皮脂建立的小鼠痤瘡模型。人體皮膚的所有部位，除了手掌和足底部位外，都含有皮脂腺，并被皮脂膜覆蓋，且該皮脂膜主要由角鯊烯、蠟單酯、TG和脂肪酸組成。提前24 h剃除注射部位的鼠毛。實驗當天，通過混合脂肪酸、TG、25%蠟單酯和角鯊烯制備人造皮脂，再向8周齡的CD-1雌性小鼠背部皮內注射約50 μL濃度為1×107cfu/μL的P.acnes的菌液，注射后立即在小鼠注射部位涂抹20 μL新鮮人造皮脂，并每天重新涂抹，持續7 d[17-18]。人造皮脂可促進皮內注射P.acnes的痤瘡模型持續存在1周。此外，角鯊烯也大量存在于人皮脂中，且人類面部和背部的皮脂濃度最高，但不存在于小鼠皮脂中，并且角鯊烯在支持痤瘡生長中的作用尚不清楚[19]。人造皮脂與P.acnes的聯合應用可促進痤瘡病理學的再現性和顯著性，但皮脂本身對皮膚病理學沒有影響[18]。然而，人造皮脂的不穩定性及價格較貴，限制其在實驗中的應用。

1.3 生物工程人化痤瘡微環境模型

生物工程人化痤瘡微環境模型(bioengineering a humanized acne microenvironment model)是將真皮細胞捕獲系統(dermis-based cell-trapped system，DBCTS)作為支架與組織腔結合使用，利用P.acnes誘導小鼠發生免疫反應的小鼠痤瘡模型。

利用DBCTS捕獲人皮脂細胞，并將捕獲的人皮脂細胞插入組織腔用以模擬皮脂腺。將含有人皮脂細胞的無菌組織腔皮下植入ICR小鼠腹部皮膚7 d后，以確保在皮下環境中完全被小鼠組織包裹；再將20 mL濃度為107cfu/mL 的P.acnes菌懸液注射到組織腔中誘導宿主免疫反應，用于模擬體內細菌感染[20-22]。人皮脂細胞包裹的DBCTS在小鼠體內創造了一種人化痤瘡微環境模型，含有細胞釋放的蛋白質的組織間充質液可用于研究P.acnes、人皮脂細胞和小鼠免疫細胞之間的相互作用[23]。最重要的是，該模型可突破小鼠不能產生抗胸腺依賴性抗原的抗體的局限，用于篩選新的抗痤瘡藥物和疫苗[20]。然而人皮脂細胞的捕獲、組織腔植入等因素使造模重復性低、造模較慢，故其造模方法仍需加以改進。

2 化學藥物刺激誘導模型

2.1 二甲苯誘導模型

二甲苯(xylene)是一種致敏劑和芳香刺激劑，在研究抗痤藥物的抗炎作用中被廣泛應用。二甲苯的傷害作用主要是由瞬時受體電位香草酸亞型(transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)受體激活介導的，但TRPV1不參與炎癥誘導作用，而是由SP通過激活血管內皮細胞上的速激肽NK1受體誘導血漿蛋白外滲，而降鈣素基因相關肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)則誘發血管舒張，并增強SP在神經支配區的促炎作用。此外，皮膚中的有機溶劑產生的活性氧和/或羰基物質(carbonyl species)通過激活辣椒素敏感神經末梢膜上的TRPV1通道參與炎癥反應[24]。

將0.03 mL二甲苯注射入成年雄性BALB/C小鼠右耳前后葉，以誘導小鼠急性耳水腫，建立小鼠炎性痤瘡模型[25]。由于炎癥反應激活引起的小鼠耳水腫使鼠耳重顯著增加，特征是疼痛、發熱、發紅和腫脹[26-27]。在組織病理學上，可檢測到嚴重的血管擴張、皮膚水腫的改變和炎癥細胞的浸潤、血漿蛋白外滲。二甲苯誘導小鼠炎性痤瘡模型建模快、重復性高，但只能反映急性炎癥早期階段的水腫化，因此該模型常通過評價血管通透性以研究抗痤藥物在體內的抗炎作用。

2.2 巴豆油誘導模型

巴豆油中含有佛波酯(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate，TPA)。TPA通過激活蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)，包括P38有絲分裂原激活蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinase，P38MAPK)和核因子kB(nuclear factor-κB, NF-κB)，以及生成白細胞介素、角蛋白細胞衍生趨化因子等介質，激活誘導磷脂酶A2酶促作用而發生炎癥，從而形成花生四烯酸代謝產物，如緩激肽、白三烯、前列腺素、IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)等促炎因子水平升高，以模擬痤瘡炎癥[28-30]。

通過在瑞士種雄性小鼠右耳涂抹20 μL 5%巴豆油，以誘導小鼠急性水腫，建立小鼠炎性痤瘡模型；通過每隔24 h在小鼠右耳涂抹20 μL 5%巴豆油誘導水腫，持續時間為9 d，以誘導小鼠慢性水腫，建立小鼠炎性痤瘡模型[31]。組織學檢測可見中性粒細胞和多形核白細胞的浸潤、組胺和血清素的釋放以及血管通透性隨著水腫的形成而增加。巴豆油單次應用可提供抗痤藥物在急性炎癥過程中抗水腫活性的數據，而巴豆油多次應用可用于評估抗痤藥物慢性炎癥過程中的抗水腫活性，但巴豆油具有毒性，建模過程中應注意防護。

2.3 角叉菜膠誘導模型

角叉菜膠(carrageenan，CG)是一種強化學物質，用于刺激釋放炎癥和促炎介質(包括前列腺素、白三烯、組胺、血清素、緩激肽和TNF-α)。炎癥的初始階段(0～1 h)是由組胺、5-羥色胺和緩激肽釋放引起的[32]。CG注射到后爪中可誘導進行性水腫在3 h內炎癥指數達到峰值，注射后3 h，被炎癥級聯的一些抑制分子調節，炎癥在24～72 h內消退[33]。CG引起的急性炎癥反應以液體和血漿蛋白滲出為特征[34]。小鼠足跖皮下注射CG后，由于前驅炎癥因子釋放在爪子組織的作用，小鼠足趾出現水腫、痛覺過敏和紅腫。通過將30 μL 濃度為1% 的CG注射KM種小鼠足底，以誘導小鼠足腫脹，建立小鼠炎性痤瘡模型[35]。該模型具有高度的重復性，常用于研究與炎性痤瘡相關的吞噬細胞浸潤和自由基產生過量以及如TNF-α、環氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)和誘導型一氧化氮合酶等炎癥介質釋放的炎癥階段[36]。

2.4 2,4-二硝基氯苯誘導模型

2,4-二硝基氯苯(2,4-dinitrochlorobenzene，DNCB)是一種環己酰亞胺苯，DCNB可通過產生過敏原特異性抗體的I型超敏反應誘導體液免疫反應[46]。小鼠皮膚暴露于DNCB可由皮膚固有免疫的激活引起致敏階段，以模擬痤瘡炎癥中因固有免疫引起的炎癥反應[38]。

在實驗前24 h，剃除5周或6周齡的BALB/C種雌性小鼠的背毛。在第0天和第4天，用無菌涂藥器將100 μL 1%DNCB涂抹在小鼠剃毛區域，以建立小鼠痤瘡模型。實驗階段，用涂藥器將100 μL 0.2% DNCB涂抹至小鼠剃毛區域，每周兩次，持續3周，以維持該模型[39]。此外，也可將1% DNCB涂抹于小鼠耳部建立小鼠痤瘡模型[40]。在小鼠背側皮膚上反復應用涂抹DNCB后，可出現紅疹、結痂和免疫器官水腫，血清CD4+和CD8+值升高，胸腺指數、脾指數有明顯升高[41-42]。DNCB致敏通常被用作誘導細胞介導免疫的方法，該模型常用以研究抗痤藥物對痤瘡中的免疫性炎癥反應的干預作用。

3 雄激素誘導模型

雄激素(androgen)是所有調節皮脂分泌的激素中最重要，可刺激皮脂的產生和痤瘡的形成。皮膚中的雄激素的局部過量分泌和/或雄激素受體的高表達，通過過氧化物酶體增殖物激活受體-C受體來調節表皮生長和脂肪細胞分化，而導致皮脂細胞和角質形成細胞的增值/分化，促使痤瘡形成。皮脂的雄激素依賴性分泌由睪酮(testosterone，T)、二氫睪酮(dihydrotestosterone，DHT)等雄激素介導。T主要通過局部轉化為DHT通過1型5α-還原酶影響皮脂腺[43]。小鼠雄激素代謝酶活性升高，可使DHT增多，導致皮脂腺增生[44]。

對SPF級KM種雄性小鼠隔日肌肉注射丙酸睪酮0.1 mL，造模時間持續14 d，建立小鼠痤瘡模型[45]。結果顯示，小鼠血清睪酮、精囊腺指數、前列腺指數均明顯升高。該模型常用于評價抗痤藥物對雄激素分泌調控效應。此外，還可以將人面部全厚皮膚移植到成年雄性CD-1裸鼠上。移植4周后，通過植入充滿T或DHT的導管給裸鼠注射雄激素，建立人皮脂腺的小鼠痤瘡模型。在人面部全厚皮膚移植到成年雄性裸鼠前至少閹割1周，以進一步控制影響皮膚移植的內分泌環境。該模型可以研究雄激素導致痤瘡的機制，也可用于研究抗痤藥物對雄激素水平異常造成痤瘡的療效[46]。

4 結語

目前，小鼠痤瘡模型的造模方式多由家兔、大鼠等痤瘡動物模型改進而來，雖然從痤瘡臨床病癥特點吻合度與癥狀模擬特點觀察而言，小鼠模型相對不具優勢，但小鼠模型在P.acnes定植與炎癥方面優于家兔。而具有重復性好、造模快、成本低、易獲得性更高的小鼠痤瘡模型在大規模抗痤藥物篩選中比大鼠痤瘡模型更具優勢。不同的小鼠痤瘡模型具有不同的研究用途，因痤瘡發病機制的復雜性，并沒有一種小鼠痤瘡模型能夠完全模擬人類痤瘡的臨床表現和病理、生化變化。小鼠痤瘡模型難以模擬痤瘡的黑頭粉刺癥狀，而家兔模型、墨西哥無毛犬模型則可模擬，因此痤瘡模型的聯合應用有利于提高痤瘡研究的可信度。利用生物工程的方法使小鼠痤瘡模型能夠從多方面反映痤瘡的表現的急性/慢性小鼠痤瘡模型是其研究方向。炎癥是痤瘡模型的核心，對痤瘡炎癥因子抑制劑的靶向研究是痤瘡治療的新方向，而建立一個完善的炎性痤瘡小鼠模型對于研究痤瘡的防治具有重大意義。此外，不同的小鼠品種表現出反映人類痤瘡早期炎癥反應的變化的能力不同，HR-1小鼠更適合于建立炎性痤瘡小鼠模型[16]。完善小鼠痤瘡模型將推動痤瘡發病機制和抗痤藥物的研究，此必對人類攻克痤瘡難題具有重要意義。