microRNA在自身免疫及血管炎性疾病發病中的作用①

羅葉萍 楊作成

(中南大學湘雅三醫院兒科，長沙 410013)

血管炎是指血管壁及血管周圍炎細胞浸潤，并伴有血管損傷，包括纖維素沉積、膠原纖維變性、內皮細胞及肌細胞壞死，又稱脈管炎。1947年Li建議將血管炎分為原發性和繼發性兩大類。原發性血管炎包括川崎病(Kawasaki disease,KD)等，繼發性血管炎包括繼發于結締組織病的血管炎如：系統性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus,SLE)、幼年特發性關節炎(Juvenile idiopathic arthritis,JIA)等[1]。多數血管炎的病因不清楚，發病機制尚未完全明了。在其免疫學和血管功能方面，從細胞和分子水平的研究已有了很大進展。近年來許多研究發現微小RNA(microRNAs,miRNAs)在部分系統性血管炎的發病機制中發揮重要作用，如SLE、 JIA、 KD和白塞病(Behcet disease,BD)。

miRNAs是一類保守的非編碼小分子RNA，可與mRNA分子3′非翻譯區(Untranslated regions,UTR)結合，在轉錄后水平調節多種蛋白質的表達。在生理過程中，miRNAs參與細胞的分化、增殖、凋亡和內穩態等。在病理條件下，異常表達的miRNAs通過對基因的調控參與疾病的致病過程。盡管miRNAs只占人類基因組的3%，卻調控大約90%的基因[2]。包括與自身免疫和血管內皮細胞功能相關的基因和信號通路等[3,4]。在過去十多年的研究中，大量的證據表明miRNAs網絡表達紊亂在自身免疫疾病如SLE等的發病機制中發揮了重要作用，但miRNAs在大部分系統性血管炎性疾病中的研究仍然處于初級階段，許多miRNA分子的靶基因及其分子作用機制仍不清楚。為進一步認識miRNAs在自身免疫性疾病及血管炎性疾病發病中的作用，現對miRNAs參與其中的作用機制綜述如下。

1 miRNA與免疫耐受

miRNAs對機體免疫耐受的形成發揮著重要作用。在免疫細胞自身免疫耐受形成過程中，miRNAs參與了與自身免疫相關的基因和信號通路的調節。其中，磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)是miRNA調控自身免疫的重要信號通路[5]。在B淋巴細胞的發育過程中,miRNA-17～92族發揮了重要作用[6]。研究發現miRNA-17～92族對B細胞的作用可通過調節PI3K信號通路及其下游多個基因，如促凋亡分子BIM基因[5]。miRNA-17～92族還可靶向PI3K信號通路的負調節因子PTEN基因。抑制B細胞中miRNA-17～92族的表達，可使BIM和PTEN蛋白上調，促進B細胞的凋亡。相反，B細胞中miRNA-17～92簇表達上調時，抑制B細胞凋亡，使外周自身反應性B淋巴細胞增多，導致自身免疫的發生[7]。Palacios等[8]發現在慢性淋巴細胞白血病(Chronic lymphocytic leukemia,CLL)的部分成熟B細胞中miRNA-22表達上調，使PTEN的表達降低，PI3K信號通路激活。最近，在白血病相關的部分研究中還發現，miRNAs可通過間接調節PI3K信號通路調節B細胞抗原受體(B-cell receptor,BCR)，導致自身免疫的發生。Mraz等[9]研究發現在CLL細胞中，miR-150表達下調。其作用機制為miR-150可靶向GAB1和FOXP1基因mRNA的3′UTR。銜接蛋白GAB1通過PI3K途徑增強B細胞的BCR信號，影響免疫耐受的形成[10]。MiRNAs還可通過PI3K信號通路影響T細胞免疫耐受形成。Henao-Mejia等[11]。研究發現miR-181缺乏小鼠的胸腺和外周缺乏成熟的自然殺傷T細胞(Nature kill T cell,NKT)。其機制為miR-181通過調節PTEN磷酸酶控制PI3K信號。Treg細胞介導的外周免疫耐受在阻止自身免疫的發生中發揮重要作用。PI3K信號通路異常可影響CD4+T細胞分化為輔助T(T-helper,Th)細胞和Treg細胞[5]。在Treg中激活PI3K信號可阻止Foxp3的表達[12]。以上研究表明，不同miRNAs可通過PI3K途徑對免疫耐受形成的多個環節進行調節，影響機體免疫耐受的形成。另外，miRNAs還可通過對mTOR、Notch等其他信號通路的調節參與免疫耐受。Dicer缺陷型CD4+T細胞中mTOR信號活性增加，TCR信號的閾值降低，miRNA調節T細胞中mTOR通路組分的表達，且這種調節是調節mTOR信號活性的關鍵[13]。miRAN-150通過靶向Notch受體家族的成員Notch3，在調節正常T細胞的發育過程中發揮重要作用[14]。

2 miRNA在自身免疫及血管炎性疾病B細胞功能紊亂中的作用機制

在SLE中，循環免疫復合物在血管壁沉積和原位免疫復合物形成可導致血管炎癥。過度活化的B淋巴細胞可使自身抗體生成增多。miRNAs引起B細胞功能紊亂參與SLE的致炎過程。SLE患者的B細胞中miRNA-1246下調和miRNA-30a過表達可使B細胞過度活化。Luo等[15]發現miRNA-1246靶向早期B細胞因子(Early B cell factor,EBF)1 可抑制其表達。相反，在正常B細胞中抑制miRNA-1246的表達可使EBF1表達上調，使B細胞表面的共刺激分子CD40、CD80和CD86增加，增加B細胞的活化。活化的B細胞還可通過激活AKT-p53信號通路降低miR-1246的表達，反過來促進B細胞活化。SLE患者B細胞中miRNA-30a的上調可直接抑制靶基因Lyn的表達，促進B細胞增殖和IgG抗體產生，參與SLE的致病過程[16]。Wu等[17]研究發現在SLE患者的B淋巴細胞中，miR-7、 miR-21、miR-22表達上調，它們可使PTEN的表達降低，促使B細胞過度活化，其具體的機制尚不清楚，但與健康對照組相比PTEN在SLE患者B細胞中表達下調，且其表達水平與SLE疾病活動度呈負相關。

3 miRNA在自身免疫及血管炎性疾病T細胞功能紊亂中的作用機制

在自身免疫血管炎性疾病中，對miRNAs介導的免疫功能紊亂的研究大部分在T細胞中。 在SLE中，miRNAs可參與CD4+T細胞表觀遺傳學的修飾和T細胞功能的調節。CD4+CD25+FoxP3+Treg細胞在調節機體正常免疫功能中起關鍵作用[18]。miRNAs可直接作用于Foxp3 mRNA的3′UTR、相關信號通路或基因間接影響Foxp3的表達，從而使Treg減少，在SLE和KD的發病過程中發揮重要作用。miRNAs還可影響Th細胞的分化參與SLE、JIA和BD的致病過程。

3.1miRNAs在SLE表觀遺傳學中的作用 SLE患者CD4+T細胞中 DNA甲基化廣泛降低，可導致自身反應性T淋巴細胞克隆。miRNAs可通過不同的方式下調T細胞DNA甲基轉移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)的表達降低DNA甲基化。 miRNA-126與DNMT1 mRNA的3′UTR結合、miR-148a調節DNMT1的編碼區，二者均可直接降低DNMT1的表達[19,20]。miRNA-21通過靶向自身免疫相關基因RASGRP1，調節DNMT1上游的Ras-MAPK信號通路[20]，miR-29b通過抑制DNMT1的反式激活因子Sp1[21]，二者通過不同的調節方式間接下調DNMT1的表達，最終降低DNA的甲基化。

3.2miRNAs在SLE患者T細胞中的作用 T細胞增殖、CD40L和ICOS蛋白表達升高、IL-4、IL-10和IL-21蛋白表達增加為T細胞活化表型。miRNA-142-3p/5p的表達下調或miR-21的過表達在SLE患者的CD4+T細胞中均可使T細胞過度活化，并使B細胞產生的IgG抗體增多。MiRNA-142-3p/5p表達下調可使相應靶基因CD48、SAP的mRNA水平升高，而miR-21的過表達，則抑制靶基因PPCD4的表達[22,23]。PPCD4是IL-10的抑制劑。因此，miR-21對PPCD4的抑制可促進T細胞IL-10分泌增多[24]。miR-410通過與信號傳導和轉錄激活因子(Signal transducer and activator of transcription,STAT)3 的mRNA的3′UTR結合STAT3的表達，降低IL-10的分泌。在SLE患者CD3+T細胞中miR-410表達下調通過增加STAT3活化，使IL-10分泌增多，增加T細胞活化[25]。 另外，Th17細胞在維持自身免疫中發揮重要作用，Liu等[26]發現在SLE患者外周血單核細胞中(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)miR-873表達上調。其主要作用機制是miR-873通過抑制靶基因叉頭框(Forkhead box,Foxo)1的表達促進Th17細胞的分化。在SLE患者Treg中，Sun等[27]發現miR-326顯著上調，且與Ets-1(E-Twenty-six-1)的mRNA呈負相關。MiR-326可與Ets-1 mRNA的3′UTR結合抑制其的表達。且在SLE患者Ets-1缺乏可降低CD4+CD25+Tregs中的Foxp3 mRNA。FoxP3是Treg細胞生成和發揮功能的關鍵轉錄因子之一。說明SLE患者miR-326表達上調可能抑制Ets-1的表達，從而抑制CD4+CD25+Tregs的功能。

3.3miRNAs在JIA患者T細胞中的作用 sJIA患者體內的Th17/Treg細胞失衡，Th17細胞比率升高，Treg細胞比率降低。JAK/STAT信號通路參與sJIA的發病過程。IL-6與JAK受體結合使STAT3磷酸化，誘導下游炎癥相關基因表達[28]。活化的STAT3還可促進Th17細胞分化，刺激炎癥細胞因子TNF-α、IL-1和IL-6產生[29]。Li等[30]通過RT-qPCR檢測，發現sJIA患者外周血單核細胞(PBMCs)中miR-19a和miR-21表達下調，而與JAK/STAT3信號通路相關的STAT3、細胞信號轉導抑制因子(Suppressor of cytokine signaling,SOCS)3、TNF-α、IL-6增加。研究表明miR-21與T細胞的成熟和分化有關，不僅在調節Th1和Th2的相互作用中發揮重要作用[31],在類風濕關節炎患者中miR-21表達下調可使STAT3活化，使Th17/Treg細胞失衡[32]。

3.4miRNAs在川崎病患者Treg細胞中的作用 FoxP3在川崎病急性期的Treg細胞中降低。Ni等[33]發現miR-155和miR-21在川崎病急性期的Treg中表達上調，而miR-31表達下調。同時，急性期患者血漿中IL-6、pSTAT3和SOCS1的水平升高，pSTAT5的水平降低。研究結果表明Treg細胞中miRNA-155表達上調可降低SOCS1的表達，增加STAT5的磷酸化[34]。磷酸化的STAT-5與FoxP3基因的啟動子結合增加FoxP3的轉錄，使FoxP3的水平升高[35]。因此，川崎病患者急性期Treg中miR-155的下調可能通過影響SOCS1/STAT5信號通路導致FoxP3+Treg減少。miR-31可直接與FoxP3 mRNA 3′UTR結合抑制FoxP3的翻譯[36]。以上研究結果表明川崎病急性期Treg的減少可能與miR-155/SOCS1信號通路的異常和miR-31的過表達有關。

3.5miRNAs在BD患者T細胞中的作用 在BD伴有急性葡萄膜炎的急性期患者中，Notch信號通路被激活，STAT3磷酸化水平增加。STAT3磷酸化可增強Th17細胞應答。在BD患者急性期中CD4+T細胞miR-23b表達下調，miR-23b與Notch信號通路的激活和Th1/Th17細胞增加有關[37]。

4 miRNA在自身免疫及血管炎性疾病細胞因子分泌中的作用機制

細胞因子在調節機體免疫應答的類型和程度中發揮重要作用[38]，可作為部分自身免疫性血管炎性疾病早期診斷的生物標志物，如：SLE和BD等。研究表明miRNA的異常表達可影響細胞因子或趨化因子的分泌，在免疫功能紊亂中發揮重要作用，可能與SLE、sJIA和BD的發病機制相關。miRNAs在川崎病中對細胞因子的影響尚未報道。

4.1miRNAs在SLE患者細胞因子和趨化因子分泌中的作用 IL-2降低可導致T細胞喪失對自身抗原的免疫耐受產生自身免疫。IL-2分泌減少可降低Tregs的含量、激活誘導的細胞死亡(Activation-induced cell death,AICD)和細胞毒活性，從而影響T細胞的功能。在SLE中MiR-200a表達下調可能增加ZEB1-CtBP2復合物與IL-2的NRE-A結合，抑制IL-2的產生miR-200a可降低IL-2的分泌。其機制可能是miR-200a降低E-box同源結合框(E-box binding homeobox,ZEB)1、ZEB2和C端結合蛋白(C-terminal binding protein,CtBP)2與IL-2沉默子A(Negative regulatory element-A,NRE-A)結合。在紅斑狼瘡小鼠(MRL/lpr)的CD4+T細胞中miR-200a表達下調，促進ZEB1-CtBP2復合物與IL-2的NRE-A結合降低IL-2的分泌。而在T淋巴細胞系中過表達miR-200a可出現相反的結果[39]。Amr等[40]發現，在SLE患者血清中，miR-31表達下調與IL-2的水平呈正相關，而miR-21表達上調與IL-2呈負相關。隨后的研究發現miRNA-31在SLE患者T細胞中表達降低，在T細胞中RhoA可通過調節活化T細胞核因子(Nuclear factor of activated T cells,NFAT)而抑制IL-2的轉錄，進一步研究表明miRNA-31通過抑制其靶基因Rho A增加IL-2啟動子的活性[41]。CCL5趨化因子也稱受激活調節正常T細胞表達和分泌因子(Regulated on activation normal T cell expressed and secreted，RANTES)，能募集白細胞在炎癥部位聚集，在SLE的發病機制中發揮重要的作用。miRNA-125a可直接靶向Kruppel樣轉錄因子(Kruppel-like factor,KLF)13基因降低RANTES的表達水平。在SLE患者的T細胞中miRNA-125a表達下調，使RANTES的表達增加[42]。

4.2miRNAs在sJIA患者細胞因子分泌中的作用 IL-6在sJIA患者急性期循環血白細胞中表達顯著升高，且IL-6的拮抗劑托珠單抗對sJIA患者的治療有效[43]。Sun等[44]通過基因芯片分析和RT-qPCR驗證發現miR-26a在sJIA患者血清中表達上調，且與IL-6的水平呈正相關，表明miRNA-26a可調節與sJIA患者先天性免疫應答相關的細胞因子IL-6的水平。另外，miR-19a的表達下調也可導致TNF-α和IL-6的分泌增加，且與miR-19a抑制SOCS3使JAK/STAT信號通路的信號傳導增強有關[30]。

4.3miRNAs在BD患者細胞因子分泌中的作用 BD外周血單核細胞產生的TNF-α、IL-6增多。Woo等[45]通過基因芯片和qPCR發現miR-638、miR-4488在BD患者巨噬細胞中表達下調，而miR-3591-3p表達上調。而且在THP-1細胞中同時過表達miR-3591-3p和抑制miR-638、miR-4488，可使IL-6 mRNA增加，因此這些miRNAs可能與白塞病IL-6的分泌有關。其具體作用機制有待進一步研究。

5 miRNA在自身免疫及血管炎性疾病先天免疫細胞功能紊亂中的作用機制

5.1miRNAs在SLE患者先天性免疫應答中的作用 樹突狀細胞是先天性免疫應答的重要組成部分[46]。pDCs激活后伴隨著大量I型干擾素(Interferon,IFN)的產生，在SLE的發病過程中發揮重要作用[47]。在新西蘭黑/白F1雜種(New Zealand Black/White F1 hybrid,NZB/WF 1)狼瘡小鼠模型骨髓來源的pDCs中，TLR7促進miR-155-Ship1信號通路的活化并增加pDCs表面CD40分子的表達[48]。干擾素調節因子(Interferon regulatory factor 5,IRF5)和STAT1是I型IFN信號通路的重要組成成分。Tang等[49]發現MiR-146a作為I型IFN信號通路的負調節因子，與SLE疾病的活動度呈負相關,并可分別靶向IRF5和STAT1基因的3′UTR在轉錄后水平抑制其表達。miRNA-146a還可通過靶向腫瘤壞死因子受體相關因子6(Tumor necrosis factor receptor associated factor 6,TRAF6)和白介素I受體相關激酶1(IL-1 receptor-associated kinase 1,IRAK1)負調控固有免疫應答[50]。Smith等[51]發現在SLE患者單核細胞中miRNA-302d表達下調可增加干擾素誘導基因(Interferon-stimulated genes,ISGs)的表達，如：MX1和OSA1。干擾素調節因子(Interferon regulatory factor,IRF)-9是miRNA-302d的靶基因，miRNA-302d表達下調通過增加IRF9的水平而增加ISGs表達。

5.2miRNAs參與調節sJIA巨噬細胞極化過程 在全身性幼年特發性關節炎(systematic juvenile idiopathic arthritis,sJIA)患者急性期發揮促炎作用的M1型巨噬細胞和發揮抗炎作用的M2型巨噬細胞出現表型轉換。研究表明miRNA-146a和miRNA-125a-5p在sJIA患者急性期單核細胞中顯著高。Li等[52]在THP1巨噬細胞中過表達miRNA-146a發現其抑制M1型極化，促進M2型極化，并通過雙熒光素酶報告基因檢測進一步證實INHBA為miRNA-146a的靶基因。Schulert等[53]在體外實驗中發現，miR-125a-5p的過表達促進THP1巨噬細胞M2型極化，表現出M2型巨噬細胞標記的CCL1、IL-1、CD136基因表達。目前的研究說明miRNA-146a和miRNA-125a-5p在體外實驗中參與巨噬細胞極化，但在sJIA患者中的作用機制有待更進一步的研究。

6 microNRA在自身免疫及血管炎性疾病血管功能紊亂中的作用機制

6.1miRNAs在SLE相關的血管損傷中的作用 SLE是內皮功能障礙的已知危險因素。IFN-α負調節內皮一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase,NOS)3的mRNA，從而降低一氧化氮合酶(eNOS)的表達和NO的產生，在與血管擴張受損有關的血管異常中起一定作用。miRNA-155參與INF-α對NOS3 mRNA的負調節過程，在缺乏miR-155時，INF-α對NOS3的抑制作用被解除[54]。因此miRNA在SLE中對內皮細胞的功能起重要作用。另外，抗磷脂(Antiphospholipid,APL)-IgG抗體或者抗雙鏈DNA-IgG抗體均可抑制內皮細胞中miRNAs(miR-124a,miR-125a,miR-222,miR-125b,miR-146a,miR-155)的表達，同時調節與ECs功能紊亂相關的分子標志物即MCP-1、TF和VCAM-1分子表達上調，而eNOS分子表達下調，表明miRNAs與SLE血管功能紊亂相關[3]。

6.2miRNAs在川崎病血管損傷中的作用 血管損傷是KD發病和死亡的主要原因，雖然川崎病誘導血管損傷的原因和分子機制目前尚不清楚，但KD受損的血管壁的主要細胞事件和組織病理學變化已經清楚，即川崎病可引起血管性內皮(Endothelial cells,ECs)損傷，受損的ECs可導致血管血栓形成，并使許多血液炎癥介質進入血管平滑肌細胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)，使ECs和VSMCs凋亡和細胞外基質的產生減少，最終導致動脈瘤的形成。血清中的miR-223不僅可以進入ECs,而且對ECs具有抗增殖和促凋亡作用，并與其在VSMC中的細胞功能一致[55]。內皮細胞間質轉化(Endothelial-mesenchymal transition,EndoMT)涉及急性KD患者冠狀動脈壁肌成纖維樣細胞介導的損傷。川崎病患兒的血清抑制內皮細胞中的KLF4/miR-483軸，導致結締組織生長因子(Connective tissue growth factor,CTGF)增加誘導EndoMT[56]。miRNAs介導的ECs凋亡可能參與KD血管損傷。Li等[57]發現miRNA-125a-5p在KD患者血清中表達上調，并在體外實驗中驗證了miRNA-125a-5p可誘導人臍靜脈血管內皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)凋亡通過靶向MKK7調節Bax/Bcl2信號通路。Wu等[58]發現川崎病患者血清中的miRNA-186在誘導血管內皮細胞凋亡中發揮重要作用，通過靶向SMAD6 基因激活MAPK信號通路。

7 miRNA在自身免疫性血管炎性疾病診斷中的價值

研究表明，miRNAs分子可作為自身免疫及血管炎性疾病診斷的潛在生物標志物。免疫細胞或循環miRNAs表達譜可為自身免疫及血管炎性疾病的發病機制、臨床診斷、預后及新的治療方案提供線索。miRNAs在自身免疫及血管炎性疾病的研究尚處于初級階段，且不同人種、疾病的不同階段及實驗方法的不同研究可能使miRNAs存在差異。所以，miRNAs的臨床應用尚不成熟。

7.1miRNAs是SLE診斷的潛在生物標志物 Kim等[59]在韓國人群中發現，血漿hsa-miR-30e-5p、hsa-miR-92a-3p和hsa-miR-223-3p在SLE患者血漿中顯著上調。且hsa-miR-223-3p與口腔潰瘍和狼瘡抗凝物顯著相關。說明hsa-miR-30e-5p，hsa-miR-92a-3p和hsa-miR-223-3p可能是SLE診斷或臨床表現的新的潛在生物標志物。

7.2miRNAs是JIA早期診斷的潛在生物標志物 在JIA患者中存在許多差異表達的miRNAs，是JIA早期診斷的潛在生物標志物。Ma等[60]通過RT-qPCR檢測發現與健康對照組相比，JIA患者血清中miR-16、miR-146a、miR-223表達升高，而miR-132降低。Kamiya等[61]進一步將JIA的生物標志物血沉(Erythrocyte sedimentation rate，ESR)和基質金屬蛋白酶3(Matrixmetalloproteinase-3,MMP-3)與microRNAs進行分析，發現在全身型和多關節型JIA患者中，miR-223和miR-16的水平分別與ESR和MMP-3呈正相關，在多關節型JIA患者中miR-146a和miR-223的水平與MMP3呈正相關，表明miR-223可能是JIA的潛在生物標志物，但具體的作用機制需更進一步的研究。

7.3miRNAs是KD診斷的潛在生物標志物 Yun等[62]發現microRNA-200c和microRNA-371-5p在急性川崎病患兒血清中表達上調，可作為KD診斷的潛在生物標志物，通過生物信息學工具(TargetScan)分析其靶基因，其聚集的信號通路主要與炎癥反應相關。

8 小結與展望

自發現miRNAs以來，其對先天性和適應性免疫應答的精密調節受到了廣泛的關注。在自身免疫及血管炎性疾病的發病中發揮重要作用。microRNAs參與調節各種免疫細胞如：B細胞、T細胞和樹突狀細胞等的功能、細胞因子和趨化因子的分泌、血管功能紊亂的調節等。至今，miRNAs在大部分自身免疫性血管炎性疾病中的研究仍處于初級階段。多種自身免疫及血管炎性疾病中存在許多差異表達的miRNAs分子，但部分miRNA的作用機制仍不清楚。隨著新的生物信息學分析工具出現、高通量基因測序方法等的應用，越來越多miRNAs的靶基因及其分子作用機制將被揭示。探索miRNAs在自身免疫性血管炎性疾病發生、發展過程中的異常表達，可在分子水平上增加對該疾病的認識，為進一步探索疾病的發病機制提供線索。