基于鋅離子螯合能力的玉米醇溶蛋白酶解條件優(yōu)化及其抗氧化性

韓家文，朱蕊芳，李 丹，楊靖宇，楊 超

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶 163319）

0 引言

玉米醇溶蛋白含有大量的含硫氨基酸和疏水氨基酸，同時(shí)國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)玉米蛋白肽具有降血壓[1]、降血脂[2]、抗氧化[3]、抗疲勞[4]、增強(qiáng)免疫系統(tǒng)[5]及解酒精毒性[6]等多種活性功能，因而受到廣泛關(guān)注。鋅（Zn）是人體及其他動(dòng)物體必需的微量營養(yǎng)素，鋅的受重視程度等同于對鐵營養(yǎng)素的重視[7]。為了提高微量營養(yǎng)素的攝入量，礦物質(zhì)以鹽的形式添加到強(qiáng)化食品中，可以改善微量元素的缺乏[8]。然而，該方法又受到低溶解性、氧化作用等諸多問題的限制。因此，以螯合的形式添加到食品中更可以提高礦物質(zhì)的生物利用率。研究表明，特定的氨基酸（組氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和半胱氨酸），以及蛋白水解獲得的生物活性肽等膳食組分，與金屬離子螯合后，大大地提高了金屬離子（Zn或Fe）的生物利用率[9]。

試驗(yàn)采用堿性蛋白酶水解玉米醇溶蛋白，以鋅離子螯合能力為評價(jià)指標(biāo)優(yōu)化酶解條件，并評價(jià)了酶解物對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 自由基、羥自由基和ABTS+·清除能力，以期為今后鋅補(bǔ)充劑和鋅強(qiáng)化功能性食品在商業(yè)化生產(chǎn)及推廣方面提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米醇溶蛋白（蛋白質(zhì)含量為86.41%），上海麥克林生化科技有限公司提供；Alkaline proteinase，北京索萊寶科技有限公司提供；亮氨酸，Biosharp白鯊生物科技提供；十二烷基磺酸鈉、氫氧化鈉，均為分析純；無水乙醇、六亞甲基四胺、硼酸、硼砂、磷酸二氫鉀（均為分析純），遼寧泉瑞試劑有限公司提供；硫酸鋅、乙二胺四乙酸（均為分析純），天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠提供；OPA（98%）、二甲酚橙指示劑，Aladdin；β-巰基乙醇，南京森貝伽生物科技有限公司提供；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2- 聯(lián)氮 - （3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸） 二銨鹽自由基（2，2'-azinobis- （3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate） free radical，ABTS+·），合肥博美生物科技有限責(zé)任公司提供。

THZ-82A型水浴恒溫振蕩器，常州潤華電器有限公司產(chǎn)品；SPECORD 210 Plus型全自動(dòng)紫外可見光譜儀，德國耶拿分析儀器股份公司產(chǎn)品；DELTA 320型pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酶解條件優(yōu)化試驗(yàn)

選擇底物質(zhì)量濃度、酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間作為考查因素。底物質(zhì)量濃度設(shè)置為10，20，30，40，50，60 mg/mL；酶添加量設(shè)置為 0.5×105，1×105，2×105，8×105，14×105，20×105U/mg；酶解溫度設(shè)置為40，45，50，55，60，65℃；酶解時(shí)間設(shè)置為1，2，3，4，5，6 h。每個(gè)設(shè)計(jì)做3個(gè)平行樣取其平均值進(jìn)行計(jì)算分析。

1.2.2 指標(biāo)的測定

采用鄰苯二甲醛（OPA） 分光光度法測定游離氨基氮方法計(jì)算玉米醇溶蛋白的酶解度[10]。酶解度按公式（1） 進(jìn)行計(jì)算。

式中：A——樣品質(zhì)量濃度，mg/mL；

hT——樣品蛋白質(zhì)的總肽鍵數(shù)，7.80 mmol/g。

鋅離子螯合能力的測定參照Wang等人的方法，計(jì)算方法略有改動(dòng)。用EDTA絡(luò)合滴定法測定螯合態(tài)鋅的含量。吸取20 mL鋅肽螯合物于錐形瓶中，加2滴二甲酚橙指示劑（0.5%水溶液），滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的六亞甲基四胺—鹽酸緩沖溶液（pH值5.0） 至溶液呈穩(wěn)定的紫色后加入4 mL緩沖液，用已標(biāo)定的0.001 mol/L EDTA溶液滴定至溶液由紫紅色變成黃色，記錄EDTA的消耗量。樣品Zn2+螯合能力按公式（2） 計(jì)算。

式中：AP——沉淀中Zn2+含量，mg；

P——樣品蛋白質(zhì)含量，g。

1.2.3 抗氧化活性試驗(yàn)

（1）DPPH自由基清除效果測定。蛋白酶解物用去離子水溶解后配成質(zhì)量濃度為1～6 mg/mL的溶液，備用。用95%乙醇溶液配制0.1 mmol/L的DPPH自由基溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。取1 mL的樣品溶液加入1 mL乙醇，再加入1 mL的DPPH自由基溶液于比色皿中，振蕩混勻后在37℃水浴中避光反應(yīng)0.5 h。于波長517 nm處測定吸光度A1。乙醇作為空白對照測定吸光度 A2，VC做陽性對照。按照公式 （3） 計(jì)算DPPH自由基清除率。

（2）羥自由基清除效果測定。分別向試管中加入0.5 mL水楊酸-乙醇溶液、0.5 mL FeSO4溶液、0.5 mL樣品溶液和1 mL H2O2溶液。混勻后在室溫反應(yīng)10 min，于波長510 nm處測定吸光A1。取0.5 mL蒸餾水代替FeSO4溶液，測得吸光度A2，取0.5 mL蒸餾水代替蛋白溶液，測得空白吸光度A0，VC做陽性對照。按照公式（4）計(jì)算羥自由基清除率。

（3） ABTS+·清除率的測定。ABTS溶液的配制：取0.1 g ABTS+·和0.029 g過硫酸鉀溶于100 mL磷酸鹽緩沖液，混合后于25℃下避光反應(yīng)16 h備用，試驗(yàn)時(shí)取2 mL該反應(yīng)液，加入18 mL磷酸鹽緩沖液，配成ABTS+·儲(chǔ)備液，避光保存當(dāng)日備用。用磷酸鹽緩沖液稀釋ABTS+·儲(chǔ)備液，于波長734 nm處測定吸光度在0.85左右，即為ABTS+·工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

測定方法：分別取0.1 mL樣品溶液，加入3.9 mL ABTS+·工作液，混勻。混合液室溫靜置10 min，于波長734 nm處測定吸光度A1，以試樣溶劑代替樣品溶液測定空白吸光度A0，以磷酸鹽緩沖液代替ABTS+·工作液測得吸光度A2，試驗(yàn)平行3次，VC做陽性對照。按照公式（5） 計(jì)算ABTS+·清除率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，用SPSS 22.0軟件進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶解時(shí)間對玉米醇溶蛋白Zn2+螯合能力及酶解度的影響

在底物質(zhì)量濃度2 mg/mL，酶添加量1×105U/mg，酶解溫度50℃，pH值12的條件下，選擇不同的酶解時(shí)間。

酶解時(shí)間對玉米醇溶蛋白Zn2+螯合能力及水解度的影響見圖1。

圖1 酶解時(shí)間對玉米醇溶蛋白Zn2+螯合能力及解解度的影響

由圖1可知，3 h之前，Zn2+螯合能力隨著酶解時(shí)間延長逐漸增加，在3 h時(shí)Zn2+螯合能力達(dá)到最大5.92 mg/g，均顯著高于2 h和4 h下的Zn2+螯合能力，因此最佳反應(yīng)時(shí)間選擇3 h。測定不同酶解時(shí)間下酶解產(chǎn)物的酶解度，酶解度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，反應(yīng)進(jìn)行3 h時(shí)，酶解度達(dá)到最高36.13%，隨后趨于平緩，說明此時(shí)反應(yīng)基本完成。

2.1.2 底物質(zhì)量濃度對玉米醇溶蛋白Zn2+螯合能力及酶解度的影響

在pH值12，酶添加量1×105U/mg，酶解溫度50℃的條件下，探究底物質(zhì)量濃度對玉米醇溶蛋白Zn2+螯合能力及酶解度的影響。

底物質(zhì)量濃度對玉米醇溶蛋白Zn2+螯合能力及酶解度的影響見圖2。

圖2 底物質(zhì)量濃度對玉米醇溶蛋白Zn2+螯合能力及酶解度的影響

由圖2可知，在底物質(zhì)量濃度6～10 mg/mL，玉米醇溶蛋白與Zn2+螯合能力逐漸升高，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，Zn2+螯合能力為5.92 mg/g，達(dá)到最高，此時(shí)的酶解度為36.13%。隨著底物質(zhì)量濃度增大，玉米醇溶蛋白Zn2+螯合能力及酶解度均緩慢降低，可能是因?yàn)榈孜镔|(zhì)量濃度增大導(dǎo)致反應(yīng)體系黏度增大，進(jìn)而影響了分子運(yùn)動(dòng)速率，降低了Zn2+螯合能力及底物和酶切位點(diǎn)的結(jié)合。

2.1.3 酶添加量對玉米醇溶蛋白Zn2+螯合能力及酶解度的影響

在底物質(zhì)量濃度2 mg/mL，酶解溫度50℃，pH值12，酶解時(shí)間5 h條件下，考查酶添加量對玉米醇溶蛋白Zn2+螯合能力及酶解度的影響。

酶添加量對玉米醇溶蛋白Zn2+螯合能力及酶解度影響見圖3。

圖3 酶添加量對玉米醇溶蛋白Zn2+螯合能力及酶解度影響

由圖3可知，隨著酶添加量的增加，玉米醇溶蛋白與Zn2+螯合能力呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當(dāng)酶添加量為2×105U/mg時(shí)，Zn2+螯合能力為9.36 mg/g，達(dá)到最高，此時(shí)的酶解度為15.55%。而后，隨著酶添加量的增大，酶解度逐漸增加，而Zn2+螯合能力呈下降趨勢，這可能是水解度太大，破壞了Zn2+與蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的原因?qū)е碌摹?/p>

2.1.4 酶解溫度對玉米醇溶蛋白Zn2+螯合能力及酶解度的影響

在底物質(zhì)量濃度2 mg/mL，酶添加量2×105U/mg，pH值12，酶解時(shí)間5 h條件下，考查酶解溫度對玉米醇溶蛋白Zn2+螯合能力及酶解度的影響。

酶解溫度對玉米醇溶蛋白酶解度及Zn2+螯合能力影響見圖4。

圖4 酶解溫度對玉米醇溶蛋白酶解度及Zn2+螯合能力影響

由圖4可知，隨著酶解溫度升高，玉米醇溶蛋白與Zn2+螯合能力呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當(dāng)酶解溫度50℃時(shí)，玉米醇溶蛋白與Zn2+螯合能力為9.36 mg/mL，達(dá)到最大，此時(shí)酶解度為15.55%。酶解溫度繼續(xù)升高時(shí)，Zn2+螯合能力逐步下降，而酶解度繼續(xù)升高，當(dāng)酶解溫度達(dá)60℃時(shí)，酶解度達(dá)到26.09%，隨后下降。這一結(jié)果表明，玉米醇溶蛋白與Zn2+螯合能力及酶解度并不是呈正相關(guān)的關(guān)系。

根據(jù)以上單因素結(jié)果，在反應(yīng)體系pH值12條件下，底物質(zhì)量濃度10 mg/mL，酶添加量2×105U/mg，酶解時(shí)間180 min，酶解溫度50℃，玉米醇溶蛋白與Zn2+螯合能力最佳，達(dá)到9.36 mg/g。在最適條件下，利用堿性蛋白酶酶解玉米醇溶蛋白，制得玉米醇溶蛋白鋅離子螯合物（ZA）備用。

2.2 玉米醇溶蛋白鋅離子螯合物抗氧化能力

玉米醇溶蛋白及其鋅離子螯合物DPPH自由基清除活性見圖5。

圖5 玉米醇溶蛋白及其鋅離子螯合物DPPH自由基清除活性

由圖5可知，隨著ZA質(zhì)量濃度增大，DPPH自由基清除率明顯增強(qiáng)。質(zhì)量濃度為8 mg/mL時(shí)，玉米醇溶蛋白對DPPH自由基清除率為52%，玉米醇溶蛋白鋅離子螯合物對DPPH自由基清除率為76%，顯著高于未反應(yīng)的玉米醇溶蛋白（p＜0.05）。

羥自由基是一種危害較大的氧自由基，在生物體內(nèi)能與蛋白質(zhì)等物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)并破壞其活性的能力。

玉米醇溶蛋白及其鋅離子螯合物羥自由基清除活性見圖6。

由圖6可知，ZA與未反應(yīng)的玉米醇溶蛋白清除羥自由基的能力隨蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的增大而增大。質(zhì)量濃度為6 mg/mL時(shí)，玉米醇溶蛋白的羥自由基清除率為36%，ZA的羥自由基清楚率為71%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于反應(yīng)前的玉米醇溶蛋白（p＜0.05）。

ABTS+·廣泛用于樣品的抗氧化能力測定，蛋白樣品與ABTS自由基反應(yīng)使其褪色，吸光度越低，表明樣品的抗氧化能力越強(qiáng)。

玉米醇溶蛋白及其鋅離子螯合物ABTS+·清除活性見圖7。

圖6 玉米醇溶蛋白及其鋅離子螯合物羥自由基清除活性

圖7 玉米醇溶蛋白及其鋅離子螯合物ABTS+·清除活性

由圖7可知，隨著蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的增大，玉米醇溶蛋白與ZA對ABTS+·清除率均有增加。質(zhì)量濃度為6 mg/mL時(shí)，玉米醇溶蛋白的ABTS+·清除率36%，ZA的ABTS+·清除率為 58%，表明 ZA的ABTS+·清除率更高一些。

綜上所述，與玉米醇溶蛋白相比，玉米醇溶蛋白經(jīng)堿性蛋白酶酶解后，其鋅離子螯合物對DPPH自由基、羥自由基、ABTS+·清除能力均有不同程度的增加。

3 結(jié)論

以Zn2+螯合能力為考查指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)，確定了堿性蛋白酶酶解玉米醇溶蛋白的最佳條件為反應(yīng)體系pH值12，底物質(zhì)量濃度10 mg/mL，酶添加量2×105U/mg，酶解時(shí)間180 min，酶解溫度50℃，玉米醇溶蛋白與Zn2+螯合能力最佳，達(dá)到9.36 mg/g。在最適反應(yīng)條件下酶解獲得的玉米醇溶蛋白鋅離子螯合肽，其DPPH自由基、羥自由基、ABTS+·的清除能力較未反應(yīng)的玉米醇溶蛋白的有顯著提高，表現(xiàn)出較好的抗氧化能力，為玉米醇溶蛋白的進(jìn)一步加工提供參考。