超高壓液相色譜-串聯質譜法測定糧食中多種真菌毒素殘留

鐘世歡，葉佳明，葉磊海，裘鈞陶，王慶齡，王 京，應寒松

（1.浙江公正檢驗中心有限公司，浙江杭州 310009；2.浙江贊宇科技股份有限公司，浙江杭州 310009）

真菌毒素（Mycotoxin），是真菌在生長過程中產生的有毒代謝產物，包含多種化學結構不同的物質，易誘發人畜各種生理損害，目前是各種糧食、農副產品的主要污染物之一[1]。家畜被飼喂含有真菌毒素的飼料會導致病患率升高，生產性能下降，同時其組織中可能會殘留真菌毒素，通過食物鏈，逐級傳遞給食用者，對食用者的健康構成潛在危害。這些真菌毒素不僅具有致癌、致畸和致突變等作用，還具有肝細胞毒性、中毒性腎損害、生殖紊亂、免疫抑制等危害，對機體造成永久性損害甚至死亡，對人類和動物健康造成極大威脅[2]。因此，為監測食品受污染，需加強對真菌毒素的檢測力度。同時為保障食品安全，減小人群的真菌毒素暴露危險，因此建立一套有效的檢測食品中多種真菌毒素含量的方法具有一定的社會意義。

目前檢測食品中真菌毒素的方法有很多，主要包括薄層色譜法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）、酶聯免疫吸附法（ELISA） 等[3-4]。但是，這些方法存在著一定缺陷。如薄層色譜法、酶聯免疫法只是半定量方法，液相色譜法定量較為準確，但其選擇性較差、定性能力不足、靈敏度較低，而且這些方法都只能檢測某一種或者某一類最多4種真菌毒素，涉及多成分同時檢測的方法甚少。隨著HPLC-MS/MS儀器的成功應用，利用其專屬性強、選擇性好、靈敏度高、操作簡單省時等優勢，可彌補前述方法的不足，對多組分同時進行定性和定量分析，使該技術在分析檢驗中得到廣泛應用[5-6]。

試驗以80%乙腈水為提取液，糧食谷物等樣品經過超聲提取后，使用固相萃取柱凈化雜質，以超高壓液相色譜串聯質譜法進行定性、定量檢測分析，該方法較好地控制了基質效應，且簡單高效。

1 試驗設計

1.1 儀器和試劑

Agilent1260型超高效液相色譜儀、Agilent 6460型三重四極桿質譜儀、AR2140型電子分析天平、MP1100B型電子分析天平、KS-300EI型超聲波、Centrifug-5804R型臺式離心機、Milli-Q型純水儀等。

甲醇（色譜級）、乙腈（色譜級）、甲酸（色譜級）、19種真菌毒素標準品、Oasis PRiME HLB固相萃取柱。

1.2 試驗方法

（1） 提取。稱取樣品約5.00 g（精確至1 mg），置于50.0 mL離心管中，加入10.00 mL乙腈-水（80∶20，V∶V） 混合提取液，渦旋30 s，超聲提取20 min，離心，取上清液5.00 mL，加入10 mL乙腈飽和的正己烷去脂，取下層清液備用。

（2） 凈化。將上述液體上樣Oasis PRiME HLB型柱，以1滴/s的速度過柱，收集洗脫液于試管中，再用3 mL乙腈-水（80∶20，V∶V） 溶液淋洗小柱，收集全部流出液后，在40℃下用氮氣吹至液面低于1 mL，并用50%甲醇水溶液定容至1.00 mL，漩渦混勻，過0.22 μm微孔濾膜，經液相色譜-串聯質譜測定。

（3） 色譜條件。色譜柱：Agilent RRHD SB-C18型柱 （100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫 35℃，進樣量5 μL，流動相A：0.1%甲酸水溶液或水溶液（負離子使用），流動相B乙腈，流速0.3 mL/min，停止時間12.0 min。

梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件

（4） 質譜條件。離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：負離子監測模式和正離子監測模式；檢測方式：多反應監測（MRM）；毛細管電壓4.0 kV；霧化器（N2）壓力35 psi；干燥氣（N2）溫度350℃；干燥氣（N2）流速10 L/min。

19種真菌毒素的相關質譜檢測參數見表2。

表2 19種真菌毒素的相關質譜檢測參數

2 結果與分析

2.1 樣品提取的優化

目前，霉菌毒素的提取方法主要以甲醇、乙腈及其與水的混合溶液為提取劑。鑒于玉米赤霉醇及其類似物和黃曲霉類毒素為脂溶性物質，難溶于純水，溶于大多數有機溶劑。試驗使用乙腈水溶液作為提取液，保證目標物提取，同時沉淀部分蛋白降低基質效應。現比較了70%，80%，90%（V/V） 的乙腈-水溶液的提取效率，并對提取方法、提取時間等條件進行比較。試驗表明，80%（V/V）乙腈-水溶液，超聲提取20 min對各真菌毒素的提取效果總體效果最佳。

2.2 凈化方式的優化

由于糧食制品中含有大量淀粉糖類及磷脂、脂肪等親脂性雜質的存在，降低色譜柱壽命，同時增大基質效應干擾目標化合物的分析。采用固相萃取凈化方法是復雜基質中痕量檢測進行凈化的常用方法。若選擇了專一性較強的萃取小柱對測定某種或某類化合物效果較好，但若用于多組分中性質差異較大的樣品，往往對某些組分的吸附性較差而得不到滿意的效果。試驗比較采用了Oasis HLB和Oasis PRiME HLB 2種不同類型的固相萃取小柱進行樣品凈化處理比較。Oasis HLB型萃取小柱要求在大比例水相的條件下上樣，才會使目標物在柱子上得以保留，這就要求把提取液中的乙腈蒸發并置換成水相，增加了前處理時間，而且玉米赤霉烯酮的回收率穩定性較差，無法準確定量。因此，試驗利用Oasis PRiME HLB型萃取小柱可用80%乙腈水的提取液直接通過，吸附磷脂及非極性干擾物，而所有的待測物無吸附等特性，這樣既能使干擾物有效去除，確保所有待測組分無損失，同時在凈化過程中也省去了溶劑轉換的過程，簡化了操作步驟。故試驗采用Oasis PRiME HLB型萃取小柱進行樣品的凈化。

2.3 線性關系和檢測限

以19種真菌毒素的質量濃度為橫坐標、對應的響應值為縱坐標，進行線性回歸。

19種真菌毒素的線性方程、線性關系見表3。

表3 19種真菌毒素的線性方程、線性關系

2.4 精密度與回收率

按試驗液相色譜-串聯質譜測定方法操作，對大米、玉米、大豆及花生陰性樣品分別進行2個水平6次重復性加標回收試驗。加標的回收率為73.4%～108.9%，相對標準偏差均小于10%。結果表明，此方法具有良好的準確性和可靠性。

19種真菌毒素的加標回收和重現性（n=6）見表4。

3 結論

試驗建立了HPLC-MS/MS法測定糧食中黃曲霉毒素（B1，B2，G1，G2，M1，M2）、伏馬毒素（B1，B2，B3）、赭曲霉毒素A和B、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、α-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇等19種真菌毒素的檢測方法。該方法優化了前處理提取、凈化，色譜和質譜條件，使其有良好的分離度，同時該方法簡單、靈敏度高、專屬性強，節省大量的人力物力資源和時間，為監管和質量控制提供了有利的技術支持，可用于實際樣品的測定。

表4 19種真菌毒素的加標回收和重現性（n=6）

序號 名稱 加標量/μg·kg-1回收率/%1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0黃曲霉毒素B1黃曲霉毒素B2黃曲霉毒素G1黃曲霉毒素G2黃曲霉毒素M1黃曲霉毒素M2伏馬毒素B1伏馬毒素B2伏馬毒素B3赭曲霉毒素A 0.50 2.00 0.50 2.00 0.50 2.00 0.50 2.00 0.50 2.00 0.50 2.00 50.00 200.00 50.00 200.00 50.00 200.00 5.00 20.00 73.6～85.3 81.2～105.1 74.9～85.1 82.1～108.3 73.4～87.9 79.2～97.9 74.2～103.6 86.0～107.9 81.8～103.6 86.2～99.2 80.2～100.6 86.8～106.7 84.7～103.7 87.3～106.1 79.6～100.6 85.4～108.1 82.2～102.6 89.3～108.9 85.5～101.6 85.9～104.9 RSD/%5.4 8.5 4.7 8.8 7.1 5.1 9.5 7.8 9.2 6.3 8.9 8.7 6.3 7.7 8.7 9.2 8.8 7.8 6.9 8.2序號 名稱 加標量/μg·kg-1回收率/% RSD/%11赭曲霉毒素B 12脫氧雪腐鐮刀菌烯醇133-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇1415-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇15玉米赤霉烯酮16β-玉米赤霉烯醇17α-玉米赤霉醇18玉米赤霉酮19α-玉米赤霉烯醇5.00 20.00 50.00 200.00 50.00 200.00 50.00 200.00 1.00 5.00 1.00 5.00 1.00 5.00 1.00 5.00 1.00 5.00 80.8～92.0 88.8～104.6 73.5～86.6 80.8～101.7 78.3～98.7 85.9～106.2 79.5～100.7 93.9～107.1 79.6～99.6 82.4～101.3 75.2～96.2 87.9～105.1 77.7～95.7 81.9～104.1 76.3～102.6 86.3～107.9 73.3～95.6 87.3～106.9 5.1 6.5 6.6 9.5 9.2 8.9 8.2 6.9 9.7 7.3 8.7 7.9 9.7 7.9 9.5 8.1 8.7 8.3