真姬菇不同生長時期胞外酶活性變化研究

宋利茹 竇宏強 席亞麗 梁倩倩 魏生龍 *

（1河西學院廳市共建甘肅省食用菌遺傳育種重點實驗室，甘肅張掖734000；2河西學院甘肅省應用真菌工程實驗室，甘肅張掖734000）

真姬菇（Hypsizygus marmoreus）又名斑玉蕈、蟹味菇、玉蕈、海鮮菇等[1]隸屬真菌界（Fungi），擔子菌門（Basidiomycota），傘菌綱（Agaricomycetes），傘菌目（Agaricales），離褶傘科，玉蕈屬（Hpysizygus），是北溫帶一種珍稀藥食兩用菌[2]。

真姬菇雖然已成為我國商品化栽培的品種之一，但由于其在栽培過程中的生產周期較長（120～140 d）[3]，限制了真姬菇工業化生產的進度，同時也導致生產成本較高。在食用菌生長發育過程中，胞外酶將培養料的大分子裂解成能使菌絲和子實體利用的小分子物質，從而為食用菌的生長發育提供所需的營養物質，因此，胞外酶在食用菌的整個生長發育過程都起著非常重要的作用[4-5]。筆者對真姬菇在菌絲長至菌袋的1/4、菌袋1/2等共8個生長發育時期的胞外酶活性進行測定，以期找出真姬菇在不同生長發育時期胞外酶活性變化規律，為揭示真姬菇基質利用機理提供理論參考，從而為工廠化生產縮短真姬菇生長周期提供借鑒。現將試驗結果總結如下。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

采用真姬菇3001，由甘肅省應用真菌工程實驗室提供。

1.2 培養基

液體培養基和PDA培養基參照參考文獻[6]的方法制備。

1.3 儀器設備

不銹鋼立式壓力滅菌鍋；恒溫搖床THZ-92A，上海浦東物理光學儀器廠；電子天平，BS223S，Sartorius；生化培養箱；超凈工作臺SW-CJ-IFD，蘇州凈化設備有限公司；電磁爐。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌種活化

從冰箱中取出供試菌株，在無菌條件下，接種于75 mL的PDA平板中央，封口，25℃恒溫培養備用[6]。

1.4.2 拌料及裝袋滅菌

真姬菇栽培料配方為：棉籽殼49%，木屑30%，麩皮15%，玉米面5%，石膏粉1%。選用17 cm×33 cm的聚丙烯塑料袋裝料，每袋裝濕料0.6 kg，于121℃下高壓滅菌2 h，于冷卻室冷卻，待料溫低于25℃后于無菌條件下接種，接種后將栽培袋移入培養室中。培養條件為溫度25℃，空氣相對濕度65%～75%，出菇條件為溫度15℃，空氣相對濕度95%，光照400 lx。

1.4.3 樣品采集

觀察記錄真姬菇生長發育，于以下8個不同生長發育時期進行取樣：①菌絲長至菌袋的1/4，②菌絲長至菌袋1/2，③菌絲長至菌袋3/4，④菌絲滿袋，⑤原基形成，⑥原基形成后7 d，⑦子實體成熟，⑧子實體采后3 d。隨機選取各生長階段菌袋3袋，每袋取樣20 g，混勻，備用。

1.4.4 酶液制備

粗酶液提取參照參考文獻[7]的方法。取混勻后的樣品5 g加入20 mL去離子雙蒸水，40℃浸提2 h，過濾、定容至 25 mL，4℃、10 000 r/min離心10 min，取上清（上清液即為粗酶液），低溫保存備用。

1.4.5 各種酶活性測定

羧甲基纖維素酶活性測定參照參考文獻[8]；濾紙纖維素酶活性測定參照參考文獻[8]；淀粉酶活性測定參照參考文獻[9]；漆酶活性測定參照參考文獻[10]；β-葡萄糖苷酶活性測定參照參考文獻[9]；愈創木酚酶活性測定參照參考文獻[11]。

1.5 數據處理

用Excel 2010軟件對數據進行統計、作圖，用SPSS19.0統計軟件進行處理[12]。

2 結果與分析

2.1 木質素降解酶

2.1.1 漆酶活性變化

由圖1可以看出真姬菇在原基形成和子實體采后3 d時漆酶活性最高，且極顯著高于其它各生長發育時期。

2.1.2 愈創木酚酶活性變化

愈創木酚酶同漆酶一樣可以衡量真姬菇對木質素的降解能力。由圖2可以看出，愈創木酚酶活性在成熟期以前沒有顯著性差異；在采后3 d愈創木酚酶活性達到最大值。愈創木酚酶在生殖生長階段活性顯著高于營養生長階段，說明真姬菇對木質素的利用主要集中在子實體生長階段。

2.2 纖維素降解酶

2.2.1 羧甲基纖維素酶活性變化

從圖3可以看出，供試菌株第8個生長階段即子實體采后3 d纖維素酶活性最高，可達到14.36 U，且顯著高于其它生長發育時期；其次子實體成熟期纖維素酶活性也顯著高于其它時期；而其中以原基形成后7 d的纖維素酶活性最低。表明真姬菇在子實體成熟和采后3 d出現了較高纖維素酶活性。纖維素酶與真姬菇子實體生長發育相關，但在真姬菇子實體形成階段纖維素酶活性均較低，可能導致真姬菇對栽培基質的利用率不高。

2.2.2 濾紙纖維素酶活性變化

由圖4可以看出，真姬菇在菌絲長至菌袋1/4時濾紙纖維素酶活性最高為3.62 U，且隨著生長發育濾紙纖維素酶活性降低，在菌絲長至菌袋1/2及原基形成后7 d時最低，并且極顯著低于其它各生長發育時期。

圖1 漆酶活性

圖2 愈創木酚酶活性

圖3 羧甲基纖維素酶活性

圖4 濾紙纖維素酶活性

圖5 β-葡萄糖苷酶活性

圖6 淀粉酶活性

2.2.3 β-葡萄糖苷酶活性變化

由圖5可以看出，在真姬菇整個生長階段，β-葡萄糖苷酶呈現先上升后下降的趨勢。并且在原基形成階段達到最高值為14.2 U，且極顯著高于其它生長發育時期；而以菌絲長至菌袋3/4時最低。

2.3 淀粉酶活性變化

由圖6看出，隨著真姬菇生長發育淀粉酶活性升高，且在子實體采后3 d纖維素酶活性最高，可達到5.87 U，但與子實體成熟期差異不顯著，與其它發育階段差異極顯著。淀粉酶活性以菌絲長至菌袋1/2最低為0.584 U。

3 小結與討論

胞外酶活性的變化反映食用菌對培養料利用情況，一直以來都是研究的熱點。

試驗結果表明，濾紙纖維素酶在菌絲長至菌袋1/4時活性最高，這可能與濾紙纖維素酶是最初對纖維素起作用的酶有關，而β-葡萄糖苷酶在營養生長階段呈逐漸上升的趨勢，且在原基形成期達到最大值，隨后逐漸下降；羧甲基纖維素酶呈逐漸上升的趨勢，且在采后3 d達到最大值，這三種酶的峰值交替出現，可能與纖維素在基質中的結構形式有關，同時也說明這三種酶分別在真姬菇不同生長發育時期起關鍵作用。

試驗表明，漆酶的活性遠高于愈創木酚酶的活性，說明漆酶在真姬菇降解木質素過程中起主要作用。漆酶和愈創木酚酶均在采收后期出現峰值，說明在這一過程中大量木質素被降解，使得纖維素被暴露，這也可能與羧甲基纖維素酶在采后后期出現峰值有關。漆酶活性在采后3 d與原基形成期差異不顯著，說明漆酶與真姬菇的原基形成有關，這一結果與袁勝東等[8]的研究結果一致，在猴頭菇、虎皮香菇[13]、白靈菇[14]及香菇[15]等的研究中也發現在原基形成期漆酶活性達到最大值，但關于漆酶與原基形成的機理尚不清楚，可以作為今后研究方向。試驗發現除了漆酶在原基形成期有最高活性外，β-葡萄糖苷酶在原基形成期也達到最高值，但β-葡萄糖苷酶是否與原基形成有關還需進一步驗證。

淀粉酶的活性也隨著真姬菇生長發育呈增加趨勢，且在成熟期及采后3 d達到最高值，說明淀粉酶可能與子實體成熟密切相關，因此，可以在真姬菇的栽培基質中適當加入淀粉類物質，可能有助于提高真姬菇的產量。

綜上所述，真姬菇培養料中降解木質素的漆酶和愈創木酚酶在菌絲生長階段活性均較低，可能導致木質素降解緩慢，而木質素又是纖維素和半纖維素被降解的前提，因此，真姬菇菌絲生長階段由于養分供應不充足而生長緩慢，這也可能是真姬菇生長周期較長的主要原因。可以考慮繼續優化真姬菇栽培料配方，以期找到能縮短栽培周期的最優配方。其次，漆酶可能與真姬菇原基形成有關，可以考慮通過調控漆酶的活性使真姬菇較早由生殖生長期轉入營養生長期，以縮短栽培周期。